Байкалін послаблює ожиріння, спричинене дієтою, ожиріння та дисфункцію печінки: реакція на дозу та потенційна роль шляху CaMKKβ/AMPK/ACC

Кафедра фармакології медичного факультету Південно-Східного університету

87 Dingjiaqiao Road, Nanjing, Jiangsu, P. R. China, 210009

Тел. + 86-25-83272525, електронна пошта [email protected]

Статті, пов’язані з "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Електронна пошта

Анотація

Вступ

Надмірна вага та ожиріння стали епідемією і вражають понад 2,1 мільярда людей у всьому світі [1]. Серед факторів, схильних до патофізіологічного розвитку ожиріння, надмірне споживання дієтичної енергії є найпоширенішою причиною [2]. Коли споживання енергії перевищує енерговитрати, надмірне накопичення клітинних ліпідів відбувається не тільки в жировій тканині, але і в позаматкових тканинах, таких як печінка [3,4]. Надмірне ектопічне відкладення ліпідів часто порушує нормальну клітинну фізіологічну функцію, що, якщо дозволити продовжувати без контролю, призведе до патологічного прогресування [3,4]. З розвитком ожиріння посилений ліпогенез печінки та нестерифіковані жирні кислоти в сироватці призводять до надмірного накопичення ліпідів печінки, що призводить до жирової печінки (також відомої як печінковий стеатоз), порушення функції печінки та, зрештою, печінкової недостатності [5,6]. Було підраховано, що 28,8 млн. Або приблизно 19% дорослих американців мають жирові захворювання печінки [7]. Оскільки печінка є життєво важливим органом, який бере участь у регулюванні травлення, метаболізмі поживних речовин та багатьох лікарських засобів, детоксикації та гомеостазі крові (наприклад, кольтвання), розробка засобів проти ожиріння з гепатопротекторними властивостями стала значним інтересом як для біомедичних дослідників, так і для клініцистів.

Матеріали і методи

Матеріали

Байкалін (вміст ВЕРХ 98%) був придбаний у компанії Guanghan Bio-Tech (Сичуань, Китай). Первинні антитіла проти фосфо-AMPKα (Thr172), AMPKα, фосфо-ACC (Ser79), ACC, фосфор-CaMKKβ (Ser511), GAPDH, біотинільовані білкові сходи та вторинні антитіла, мічені пероксидазою хрону, були придбані у Cell Signaling Technology (Beverly, MA, США). Антитіло CaMKKβ було з групи Proteintech (Чикаго, Іллінойс, США). Мембрани полівінілідендифториду та реагент для детектування вестерн-блот з посиленою хемілюмінесценцією (ECL) були придбані у Millipore (Billerica, MA, США). Набір для фарбування маслом червоного кольору O, набір для гематоксиліну та еозину, буфер для лізису RIPA та буфер для завантаження зразків 5X були придбані у Нанкінської сонячної біотехнології (Нанкін, Китай). Карбоксиметилцелюлоза натрію отримана від Sinopharm Chemical Reagent (Sanghai, Китай). Комплект для аналізу BCA був отриманий від Pierce Biotechnology (Рокфорд, Іллінойс, США).

Дослідження на тваринах

Біохімічні аналізи сироватки крові

Рівні тригліцеридів у сироватці крові, загальний холестерин, кількість холестерину, що міститься в ліпопротеїнах низької або високої щільності (LDL-c та HDL-c відповідно), аспартат-трансаміназі (AST) та аланін-трансаміназі (ALT), вимірювали за допомогою UniCel DxC 800 синхронних клінічних систем (Бекман Коултер, Пасадена, Каліфорнія, США) та комерційні набори клінічної діагностики (Shanghai Fuxing Changzheng Medical Co. Ltd .; Шанхай, Китай).

Фарбування гематоксиліном та еозином та оцінка стеатозу печінки

Заморожені тканини печінки розрізали (5 мкм) за допомогою мікротома (Leica Microsystems; Buffalo Grove, IL, США). Фарбування гематоксиліном та еозином проводили згідно з протоколом виробника. Стеатоз печінки оцінювали на основі бальної системи, розробленої Комітетом з патології Мережі клінічних досліджень NASH [19], та сертифікованим комісією патологоанатомом.

Олійно-червоне фарбування O

Зрізи печінки фарбували олійно-червоним набором для фарбування O і фарбували гематоксиліном для виявлення накопичення печінкових ліпідів згідно з протоколами виробника. Зображення були зроблені наосліп за допомогою світлового мікроскопа Olympus BX51 (Olympus America, Melville, NY, USA) зі збільшенням 400 ×.

Вестерн-блот-аналіз

Білки печінки екстрагували з частини подрібненої в порошок тканини за допомогою буфера лізису RIPA. Концентрацію білка визначали за допомогою набору для аналізу BCA. Білки кип'ятили у буфері для завантаження зразків 5X протягом 5 хв для аналізів імуноблотингу [20]. Рівну кількість білків печінки з кожного зразка розчиняли за допомогою 8% SDS-PAGE, переносили на мембрани полівінілідендифториду та піддавали стандартній процедурі імуноблотингу, включаючи інкубацію з первинним антитілом протягом ночі при 4 ° C. Імунокомплекси візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції та сканували для подальшого денситометричного аналізу.

Статистичний аналіз

Результати представлені як середнє значення ± SEM. Ефекти дієти з високим вмістом жиру та лікування байкаліном аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA). Для визначення відмінностей між групами проводили багаторазові порівняння за допомогою тесту Тукі. Рівень значущості прийнятий a апріорі становила ≤ 0,05.

Результати

Байкалін послаблює ожиріння, спричинене дієтами, і ожиріння печінки

Рис. 1

Байкалін послаблює ожиріння, спричинене дієтами, і ожиріння печінки. А. Маса тіла самців мишей C57BL/6J, яких годували нормальним раціоном, що служив нежирним контролем (LC), дієтою з високим вмістом жиру (HF) або дієтою з високим вмістом жиру, а також пероральним введенням трьох різних концентрацій байкаліну (100, 200 або 400 мг байкаліну/кг маси тіла/день протягом 14 тижнів відповідно). Байкалінове втручання було розпочато у віці 25 тижнів (після 16 тижнів дієтичного лікування з високим вмістом жиру). Мишам LC та HF щодня давали рівну кількість розчину натрію карбоксиметилцелюлози (300 мкл) як мишам, обробленим байкаліном. B. Співвідношення жирової прокладки епідидимуму до маси тіла (BW). C. Співвідношення печінки до маси тіла. D. Репрезентативні зображення черевної порожнини, жирової прокладки та печінки. abc: Групи без однієї букви суттєво відрізняються (P ≤ 0,05).

Байкалін послаблює гіперліпідемію, спричинену дієтою, з високим вмістом жиру

Порівняно з тим, що було у звичайній дієтичній групі, споживання дієти з високим вмістом жиру суттєво підвищувало рівень тригліцеридів у сироватці крові, загальний холестерин та ЛПНЩ, але знижував рівень ЛПВЩ у сироватці крові (P ≤ 0,05; рис. 2A-D). Ці зміни, пов'язані з дієтою з високим вмістом жиру, залежали від дози байкаліну, а більші дози байкаліну (200 та 400 мг/кг) змогли відновити всі ці параметри гіперліпідемії, порівнянні з показниками нежирних контролів (Р ≥ 0,05; рис. 2A-D).

Рис.2

Байкалін послаблює гіперліпідемію, спричинену дієтою, з високим вмістом жиру. Тригліцериди сироватки крові (панель A), загальний холестерин (B), кількість холестерину, що міститься в HDL (C) та LDL (D), вимірювали у самців мишей C57BL/6J, які годувались нормальним раціоном, що служив контролем худого стану (LC), високо жирова дієта (ВЧ) та дієта з високим вмістом жиру разом із пероральним введенням трьох різних концентрацій байкаліну (100, 200 або 400 мг байкаліну/кг маси тіла/добу відповідно). abc: Групи без однієї букви суттєво відрізняються (P ≤ 0,05).

Байкалін пом'якшує дисфункцію печінки, спричинену дієтою

Вживання дієти з високим вмістом жиру суттєво збільшило рівні сироваткової аланін-трансамінази та аспартат-трансамінази (P ≤ 0,05; рис. 3A-B). Усі три дози байкаліну змогли відновити рівень АЛТ і АСТ у мишей, що харчуються з дієтичним харчуванням, до рівня, порівнянного з нежирним контролем (Р ≥ 0,05; рис. 3А-В).

Рис.3

Хронічне лікування байкаліном послаблює дисфункцію печінки, спричинену дієтами. Трансаміназа аланіну в сироватці крові (АЛТ; панель А) та аспартат-трансаміназа (АСТ; В) вимірювались в режимах зсушеного контролю (ЛК), ожиріння з дієтою з високим вмістом жиру (СН) та дієти з високим вмістом жиру разом із пероральним введенням байкаліну (100, 200 або 400 мг байкаліну/кг маси тіла/добу відповідно). ab: Групи без однієї букви суттєво відрізняються (P≤0,05).

Байкалін послаблює індукований дієтою стеатоз печінки

Фарбування гематоксиліном та еозином показало, що прийом їжі з високим вмістом жиру суттєво індукує стеатоз печінки, про що свідчить збільшення кількості порожніх вакуолей жиру, які були або більшими, або меншими, ніж ядро гепатоцитів, відомими як макровезикулярний та мікровезикулярний стеатоз (рис. 4А). Площа стеатозу у контрольних групах дієти з високим вмістом жиру становила 43% печінкових часточок (рис. 4С). Лікування байкаліном при менших дозах (100 мг/кг/добу) помітно зменшувало кількість макровезикулярного стеатозу у мишей, що годували жиром, але мікровезикулярний стеатоз, переважно зайнятий у печінковій часточці (рис. 4А). Отже, загальна площа стеатозу у групі байкаліну 100 мг/кг зменшилась, але статистично не відрізнялася від такої у групі контролю з високим вмістом жиру (рис. 4С). Зі збільшенням дози зі 100 до 200 та 400 мг/кг байкалін значно зменшив кількість як макровезикулярних, так і мікровезикулярних стеатозів у мишей, які харчувалися дієтою з високим вмістом жиру (Р ≤ 0,05; рис. 4А та С). Відповідно до даних про стеатоз печінки, фарбування олійно-червоним кольором О підтвердило, що відкладення ліпідів було вищим у контрольній групі з високим вмістом жиру, в той час як зниження дозозалежного шляхом підвищення рівня байкаліну (рис. 4В).

Рис.4

Байкалін послаблює індукований дієтою стеатоз печінки. А. Фарбування гематоксиліном та еозином показало стеатоз у жировій печінці, спричинений дієтою з високим вмістом жиру та захисною дією байкаліну. Збільшене зображення групи HF передбачає стеатоз печінки: макровезикулярний (червоні зірки) та мікровезикулярний (зелена стрілка) стеатози характеризуються розміром порожніх жирових вакуолей, більшим або меншим, ніж діаметр ядра гепатоцитів (синя стрілка). B. Фарбування маслом O Червоного, забарвлене гематоксиліном, показало зменшення відкладення ліпідів у печінці байкаліном у мишей, які отримували їжу з високим вмістом жиру. C. Ступінь стеатозу печінки оцінювали на основі системи оцінювання, як описано у матеріалі та методах. abc: Групи без однієї букви суттєво відрізняються (P ≤ 0,05).

Байкалін послаблює інгібоване інгібуванням печінки CaMKKβ, AMPKα та фосфорилювання АСС, викликане дієтами

Фосфорилювання печінкового АСС у Ser79 (показник ферментативної інактивації), AMPKα у Thr172 та CaMKKβ у Ser511 було знижено у контрольних мишей з високим вмістом жиру (P ≤ 0,05; рис. 5A-C), у той час як більші дози байкаліну (200 та 400 мг/кг) змогли відновити свій фосфорильований статус до рівнів, порівнянних із худими контролями (P ≥ 0,05; рис. 5A-C). Рівні загальних білків CaMKKβ, AMPK та ACC не відрізнялися між групами.

Рис.5

Байкалін послаблює індуковане інгібуванням дієти з високим вмістом жиру β-кінази β (CaMKKβ), ацетил-КоА-карбоксилази (ACC) та AMP-активованої протеїнкінази (AMPKα) печінки (AMPKα) печінки. Загальний і фосфорильований білки ACC (панель A), AMPKα (панель B) та CaMKKβ (панель C) визначали за допомогою вестерн-блот. ab: Групи без однієї букви суттєво відрізняються (P ≤ 0,05).

Обговорення

Ожиріння впливає на мільярди у всьому світі і суттєво схиляє до розвитку жирової печінки, яка є основною причиною хронічних захворювань печінки [1,4,7]. Епідеміологічні дослідження показали, що надмірне споживання дієтичної енергії є однією з найпоширеніших причин ожиріння [1,2]. Використовуючи модель тваринного харчування з високим вмістом жиру, ми демонструємо, що ожиріння, спричинене дієтою, і ожиріння, а також стеатоз і дисфункція печінки можуть бути зменшені за допомогою байкаліну, поліфенольної сполуки, що міститься в Scutellaria baicalensis Georgi [8,16]. Наші дані свідчать про те, що байкалін до 400 мг/кг/добу протягом 14 тижнів був безпечним для мишей, що харчуються дієтою, а його здатність проти ожиріння та гепатопротектора збільшувалась із збільшенням доз (від 100 до 400 мг/кг/добу ). Гепатопротекторні ефекти байкаліну, як видається, пов'язані з активацією печінкового CaMKKβ/AMPK та придушенням АСС, ключового шляху регулювання печінкової функції. de novo ліпогенез.

Підводячи підсумок, дані цього дослідження демонструють, що ожиріння, спричинене дієтами з високим вмістом жиру, гіперліпідемія, жирова хвороба печінки (стеатоз) та порушення функції печінки можна лікувати байкаліном. Терапевтичний ефект байкаліну залежить від дози та забезпечує оптимальну дозу від 200 до 400 мг/кг/добу. До 400 мг/кг/день є безпечним для печінки тваринам з високим вмістом жиру на основі оцінки рівня АЛТ та АСТ. Ми також демонструємо, що печінковий шлях CaMKKβ/AMPK/ACC, ключовий регулятор печінки de novo ліпогенез, може інгібуватися збільшенням дози байкаліну і може опосередковувати, принаймні частково, терапевтичні ефекти байкаліну.

Подяка

Ця робота була підтримана грантом Південно-Східного університету. Автори висловлюють подяку Чунцзе Чжао та Хунхонг Яо за видатну технічну допомогу. Фінансист не брав участі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, підготовці рукопису чи прийнятті рішення про публікацію. Усі автори заявляють, що у них немає конкуруючих інтересів.

Заява про розкриття інформації

Усі автори заявляють, що у них немає конкуруючих інтересів.