Асоційовані з людською флорою гризуни - чи підтверджують дані дані припущення?

Пітер Сіллі

1 MB Consult Limited, Lymington SO41 3TQ, Великобританія.

2 Кафедра біомедичних наук, Університет Бредфорда, Бредфорд, Великобританія.

Резюме

Вступ

Другий приклад стосується ролі біфідобактерій; вони вважаються значною бактеріальною популяцією в шлунково-кишковому тракті людини і відіграють ключову роль у здоров'ї завдяки підтримці збалансованої мікробіоти кишечника (Reuter, 2001; Vaughan et al., 2005). Дельгадо та ін. (2008) описали корисні ефекти, що приписуються біфідобактеріям, включаючи створення здорової мікробіоти у немовлят, профілактику та лікування діареї, полегшення запору та симптомів непереносимості лактози, посилення імунних функцій, зниження рівня холестерину та придушення пухлини, серед інших (Ouwehand et al., 2002; Leahy et al., 2005). Цей рід, безумовно, має комерційне значення, оскільки багато мікробні компоненти комерційних пробіотиків належать до групи біфідобактерій (Yeung et al., 2002; Fasoli et al., 2003). Переглянуті дані свідчать про те, що ця важлива група організмів не завжди імплантується в модель гризунів HFA.

Основа для моделі HFA

Сільві та його колеги (1999) у дослідженні, що вивчали модифікацію флори кишечника стійким крохмалем, заявили, що,

Дослідження проводили на щурах, асоційованих з флорою людини, які забезпечують більшу значимість для людини, ніж використання звичайних щурів флори. Щури, пов'язані з флорою людини, отримані шляхом колонізації безмікробних щурів фекальними бактеріями людини, розвивають і підтримують флору з бактеріологічними та метаболічними характеристиками, подібними до зрілої мікрофлори товстої кишки.

Як підтримку цього далекосяжного висловлювання автори посилаються на роботу Маллетта та його колег (1987), Хіраями та його колег (1995) та Румні та Роуленда (1992), яка неодноразово використовувалась як обгрунтування моделі HFA. Необхідно детально вивчити ці посилання на джерела.

Маллетт та його колеги (1987) порівнювали активність ферментів шлунково-кишкового тракту (β-глюкозидаза, β-глюкуронідаза, нітрат-редуктаза та нітроредуктаза) у звичайних щурів та HFA та фекалій людини. Вони дійшли висновку, що звичайні та HFA щури виявляли порівнянні ферментні активності, подібні до тих, що виявляються в фекаліях людини, за винятком нітрат-редуктази, яка виявляла незначну активність у звичайних щурів. Однак звичайна флора щурів по-різному реагувала на щури HFA та фекалії людини, коли дієта доповнювалась пектином, що стимулювало активність нітрат-редуктази. Таким чином, докази подібності флори між моделлю гризунів HFA та людиною базуються не на прямих бактеріологічних даних, а на схожості в активності ферментів трьох із чотирьох випробуваних ферментів.

Автори підкреслюють, що причини відмінностей між донорською та встановленою флорою не ясні. Незалежно від інокульованих фекалій людини, кількість Bacteroides spp., Clostridium spp., Анаеробних коків та Streptococcus spp. у всіх мишей HFA були вищими, ніж у інокулятів. Хіраяма та його колеги (1995) припускають, що бактеріальний баланс у кишечнику мишей HFA може контролюватися фізіологічними умовами кишечника миші, а не балансом мікробів у фекаліях людини. Як зазначають вони, це зменшить варіабельність бактеріального складу серед груп мишей HFA у порівнянні з тим, що відбувається у зразках фекалій людини.

Діяльність β-глюкозидази та β-глюкуронідази мишей HFA була подібною до діяльності у людини, але активність нітратредуктази та нітроредуктази у мишей HFA відрізнялася від активності як у людини, так і у звичайних мишей. Крім того, концентрації гнильних продуктів у фекаліях HFA мишей значною мірою відрізнялися від концентрацій у фекаліях людини, але подібні до тих, що виявляються у звичайних мишей. Склад фекальних SCFA у мишей HFA був більш подібним до складу у людей, ніж у звичайних мишей, але концентрація кислоти була значно нижчою, ніж у людини. Таким чином, бактеріальний метаболізм у кишечнику мишей HFA відображав аналіз людських фекалій щодо деяких метаболічних дій, але не інших. Автори пропонують дві гіпотези, якими можна пояснити результати:

домінантні види бактерій кожної бактеріальної групи у мишей HFA можуть змінитися від видів, присутніх у інокульованих фекаліях людини; і

бактеріальний метаболізм може змінитися через змінене кишкове середовище.

Подальший коментар був зроблений, що варіації складу та метаболічної активності мікробіоти фекалій серед груп мишей HFA не були особливо очевидними, і, що ще важливіше, індивідуальні варіації серед інокульованих людських фекалій не були відображені в групах мишей HFA і що деякі характеристики фекалії кожного донора людини майже не відображались у мишей HFA.

Хоча ця стаття широко цитується як обґрунтування використання гризунів HFA як моделей для вивчення флори шлунково-кишкового тракту у людини, схоже, не було ретельного вивчення даних, навіть абстрактного заключного речення:

Ці висновки вказують на те, що миші HFA забезпечують стабільний і цінний інструмент для вивчення екосистеми та метаболізму мікробіоти фекалій людини, але вони мають деякі обмеження як модель.

Остаточне допоміжне посилання, згадане вище, було отримано з огляду, проведеного Рамні та Роулендом (1992). В рамках огляду вони цитували роботу Хазенберга та його колег (1981), які завдяки детальному бактеріологічному дослідженню показали, що загальний бактеріальний склад миші HFA був подібний до складу людини та відрізнявся від складу звичайної миші. Далі ці працівники продемонстрували, що сліпа кишка миші HFA значно зменшилася в розмірі до рівня, еквівалентного в порівнянні з масою тіла людини. Відмінності між флорою мишей HFA та флорою звичайної миші легко продемонструвати, оскільки вони повідомляли про заміну флори людини мишачою протягом 2 тижнів, якщо мишей не утримували у відповідних ізоляторах. Це досить важливий момент, оскільки він припускає, що людська флора насправді не стабілізована у мишей, і що вона може бути легше порушена під впливом антибіотиків, ніж це було б у шлунково-кишковому тракті людини.

Дюклюзо та його колеги (1984) підтвердили роботу Хазенберга та його колег (1981), і, згідно з Румні та Роулендом (1992), це підтвердили також Пекке та його колеги (1986). Проте, уважно прочитавши дослідження Pecquet та його колег (1986), виявляється, що, хоча вони продемонстрували схожість у флорі між мишами HFA та добровольцями-людьми, це було лише щодо Enterobacteriaceae та загальних анаеробів, жодна інша група не тестувалась і не було порівняння з флора звичайних тварин. Ще одна помилка в огляді Рамні та Роуленда (1992) трапляється у цитуванні раніше обговореної статті Маллетта та його колег (1987). Огляд робить висновок з роботи Маллетта та його колег (1987):

Коли HFA тварин порівнювали з їх звичайними аналогами флори, всі чотири вивчені мікробні ферменти показали значні відмінності в активності.

Огляд статті Маллетта та його колег (1987), як описано раніше, показує, що це не так. Огляд Rumney and Rowland (1992) також представив деякі раніше не опубліковані дані, які показують, що метаболізм 2-аміно-3-метил-3H-імідазо [4,5-f] хіноліну відбувався швидше у суспензіях бактерій, виділених із фекаліями щурів та мишей, ніж з людськими фекаліями, проте швидкість реакції з фекаліями HFA щурів була подібною до такої з фекаліями людини. Уорд та його колеги (1990) у подібному дослідженні досліджували вплив різних типів харчових жирів на утворення N-нітросопроліну у щурів, що не містять мікробів, звичайних та HFA. Результати у щурів HFA та людей були подібні та протиставлені результатам у звичайних щурів.

Очевидно, що докази, що підтверджують думку про те, що дослідження HFA на щурах є більш актуальними для ситуації у людини, ніж дослідження на звичайних щурах (Silvi та ін., 1999), не є такими суттєвими, як можна було б подумати в іншому випадку. Дослідження Хіраями та його колег (1991; 1995) є єдиними вичерпними допоміжними дослідженнями, які провели ретельний бактеріологічний аналіз. Існує ряд досліджень, що забезпечують опосередковану підтримку моделей гризунів HFA, що передбачають ситуацію у людини щодо метаболізму шлунково-кишкового тракту. Роуленд та Танака (1993) описали годування трансгалактозильованих олігосахаридів (TOS) щурами HFA, що призвело до збільшення загального анаеробу, Bifidobacterium та Lactobacillus spp. кількість, але не для Bacteroides spp. Ці результати узгоджувалися з результатами, опублікованими Ito та його колегами (1990), які годували TOS людьми добровольцями та виявили значне збільшення рівня Bifidobacterium spp. та Lactobacillus spp. у фекаліях, хоча не спостерігалося змін у кількості загальних бактерій.

Маллетт та його колеги (1989) досліджували вплив рН інкубації на активність ферментів щурів та кишкової флори людини (β-глюкозидаза, β-глюкуронідаза та нітрат-редуктаза). На всі три ферменти впливав рН, що ілюструється активністю β-глюкозидази, яка зменшувалась із збільшенням рН. В інших випадках флора щурів та людини демонструвала чіткі профілі з активністю нітратредуктази, що не виявляється в фекаліях людини нижче рН 6,6, тоді як флора сліпої кишки щурів демонструвала оптимальне зниження нітратів навколо нейтральності. Найбільш виражену різницю між видами господаря було виявлено при β-глюкуронідазі. Автори вважали, що розбіжний профіль для двох джерел кишкового матеріалу може відображати відмінності у поширенні позитивних для β-глюкуронідази організмів, що присутні в кишці щурів або людини, оскільки різні види бактерій мають дуже різний рівень цього ферменту (Cole et al ., 1985).

Окрім дослідження Хіраями та його колег (1991; 1995), видається небагато таких всебічних досліджень, які б розглядали порівняльний бактеріологічний аналіз мікробіоти фекалій звичайних гризунів HFA та фекалій людини-донора. Однак у літературі є інші дослідження, які вказують на відмінності між мікрофлорою фекалій звичайних гризунів, гризунів HFA та людини.

Ще в 1980 р. Рейбо та його колеги (1980) провели низку захоплюючих експериментів, в ході яких бактерій з травного тракту людини та різних тварин імплантували мишей-гнотобіотиків. У першому експерименті чотирнадцять мікробних штамів, виділених із звичайних щурів, інокулювали на аксенних щурів та мишей, які отримували однакові дієти. Популяції цих організмів, які закріпилися у фекаліях ноготобіотичних дорослих щурів-реципієнтів та мишей, були досить подібними, крім одного штаму Clostridium sp., Який встановлений у щурів, але не у мишей. Потім складну флору із звичайної курки успішно імплантували дорослим мишам-гнотобіотикам, таким чином, що вона виявляла інтактний бар’єрний ефект проти Salmonella typhimurium. Нарешті Рейбо та його колеги (1980) прищепили фекалії від донора людини дорослим мишам-реципієнтам гнотобіотиків. Колонізація була досягнута, хоча представники родів Bifidobacterium, Lactobacillus і Clostridium не змогли встановити, незважаючи на те, що вони були присутніми в донорському щепці. Тим не менше колонізуюча флора все ще мала ефективний бар'єр проти токсигенного штаму Clostridium difficile, хоча цей бар'єрний ефект мимовільно зник через кілька тижнів.

Гарсія-Лафуенте та його колеги (2001), які працюють з безпатогенними щурами Sprague-Dawley, чітко показали, що бар'єрна функція товстої кишки модулюється складом флори коменсального шлунково-кишкового тракту. Встановлено, що колонізація товстої кишки кишковою паличкою, Klebsiella pneumoniae та Streptococcus viridans порушує функцію бар’єру товстої кишки, тоді як колонізація Lactobacillus brevis зменшує проникність товстої кишки і, таким чином, покращує бар’єрну функцію.

Інші експериментальні дослідження показали, що певні штами лактобактерій можуть запобігати або зворотити розлади кишкової проникності. Тривалий виклик коров’ячого молока у щурів-сисунів підвищує проникність кишечника для інтактного білка, а пероральна бактеріотерапія штамом Lactobacillus casei GG протидіє збільшенню проникності кишечника (Isolauri et al., 1993). З цих досліджень зрозуміло, що коменсальні бактерії можуть впливати на бар'єрну функцію товстої кишки в нормальних непатологічних станах і що взаємодія між флорою товстої кишки та стінкою кишечника також може бути важливою. Цей останній згаданий пункт особливо важливий з огляду на специфічні для виду механізми прикріплення, завдяки яким багато Lactobacillus spp. буде демонструвати вкладення для конкретного хоста. Причиною висвітлення цих висновків є те, що невдача однієї бактеріальної групи колонізувати модель може завдати шкоди результатам. Наш сучасний стан знань не дозволяє нам бути впевненим у важливості відповідних бактеріальних груп. Однак загальновизнаним є те, що Bifidobacterium spp. є важливою групою в екосистемі шлунково-кишкового тракту, однак вони є групою, яка постійно не може утвердитися в моделі HFA.

Відмінності між зародковими та звичайними гризунами

Епітеліальна структура слизової оболонки кишечника ссавців відображає абсорбційну та секреторну активність різних її сегментів. Апікальна поверхнева мембрана епітеліальних клітин кишечника має чітко визначений шар глікопротеїнів та гліколіпідів - глікокалікс, який бере участь у ключових клітинних процесах, таких як адгезія, розпізнавання антигенів, диференціація та транспорт. У елегантному дослідженні, що вивчало вплив дієти та мікрофлори кишечника на схеми зв’язування лектину кишкових муцинів у щурів, Шарма та Шумахер (1995) описали загальне зменшення залишків d ‐галактози, пов’язаних із сиаловою кислотою, у звичайних порівняно з щурами, що не містять мікроби, та втрата градієнта крипти до поверхні експресії фукозилу у товстій кишці щурів HFA. Вважалося, що ці відмінності зумовлені різними штамами глікозидаз у двох різних флорах.

У подальшому дослідженні Sharma та його колеги (1995) повідомили, що хоча вплив людської флори на структуру кишечника та склад слизу щурів HFA багато в чому був подібний до звичайних щурів, існували відмінності, особливо у складі поверхні та келихоподібний слиз і довжина клітин товстої кишкової крипти. Хоча автори визнають, що ці результати можуть відображати реальні відмінності у відповіді на два типи флори, вони також вважають можливим, що коли людська флора прищеплюється у вільну від зародків тварину, її встановлення та подальша взаємодія з кишковим трактом може спричинити зміни не спостерігається при корінній флорі, де колонізація не підлягає експериментальним маніпуляціям.

Taché та його колеги (2000) досліджували дію карагенанів як потенційних збудників пухлини у звичайних щурів та HFA. При високих рівнях доз у звичайних щурів були виявлені аномальні вогнища крипт, тоді як, на відміну від цього, ніяких ефектів у щурів HFA не спостерігалося. Ці висновки підтвердили гіпотезу про те, що саме мікрофлора кишечника тварини-господаря бере участь у токсичній дії карагенанів у товстій кишці щурів.

Дослідження, що порівнюють метаболізм у гризунів HFA та людини

Andrieux та його колеги (1993) досліджували бродіння інуліну у вільних від зародків щурів, асоційованих з кишковою флорою людини від виробників метану та неметану. Флора людини-донора в обох випадках зберігала свої ферментативні властивості при посіві на щурів, що не містять зародків, яких годували контрольною дієтою. Бактеріальна флора від виробників метану людини лише спричинила виробництво метану, тоді як виробництво водню було подібним як у метану, так і у неметанових щурів. Концентрації SCFA у слівих клітинах були меншими у щурів, що виробляють метан, ніж у виробників неметану, як це було виявлено в фекаліях людини, але концентрація молочної кислоти була вищою порівняно з такою у щурів, що не виробляли метан.

Таблиця 1

Короткий висновок з основних робіт.

Посилання Вивчення предметів Аналіз Висновки

Маллетт та ін. (1987)	Звичайні щури, щури HFA та людські фекалії	Біохімія	Висновок про те, що флора була подібною між усіма трьома суб'єктами дослідження на основі непрямих вимірювань, і справедливий лише для 3 з 4 тестованих ферментів
Хіраяма та ін. (1991)	Миші HFA	Бактеріологія	Біфідобактерії, не імплантовані мишам HFA
Хіраяма та ін. (1995)	HFA, звичайні миші та фекалії людини	Бактеріологія та біохімія	Відмінності в імплантованій флорі, Bifidobacterium не імплантований у всіх мишей.
Хіраяма та ін. (1995)	HFA, звичайні миші та фекалії людини	Бактеріологія та біохімія	Відмінності в активності ферментів та бактеріальному обміні
Хазенберг та ін. (1981)	HFA, звичайні миші та фекалії людини	Бактеріологія	Флора HFA схожа на людську, але відрізняється від звичайних мишей
Пеке та ін. (1986)	Миші HFA та фекалії людини	Бактеріологія	Висновок про подібність у флорі, але лише обстежені ентеробактерії та загальні анаероби

Без питань?

Результати порушують питання про адекватність фекальних мікроорганізмів, пов’язаних з гризунами, як остаточної моделі для вивчення екології кишкового тракту людини. Зникнення вибраних видів та неспроможність інших колонізувати можуть вплинути на результати досліджень. Більше того, сильно знижена метаболічна активність мікробіоти фекалій людини у миші може зменшити значущість результатів метаболічних досліджень, якщо їх екстраполювати на ситуацію у людини. Однак модель може бути корисною для досліджень стійкості до колонізації проти різних кишкових патогенів.