Втрата білків Smarc погіршує розвиток мозочка

Анотація

AT/RT
мозку
мозочок
розвитку
Смарк
пухлина

Вступ

Матеріали і методи

Трансгенні миші.

Покоління мишей, що несуть флангований loxP екзон 1 гена Smarcb1 або ген, флангований loxP Smarca4, було раніше описано (Roberts et al., 2002; Indra et al., 2005). Ці миші були схрещені мишами Math1-cre (Schüller et al., 2007) для отримання Math1-cre: Smarcb1 fl/fl та Math1-cre: Smarca4 fl/fl мишей. Мишей утримували в стандартних умовах. Генотипування проводили за допомогою стандартної ПЛР із використанням специфічних для праймерів Cre (5′-TCCGGCTGCCACGACCAA-3 ′ і 5′-GGCGCGGCAACACCATTTT-3 ′), специфічних для праймерів Smarcb1 (5′-TAGGCACTGGACATAAGGGC-3 ′ і 5′-GGAC-GTC-GAC-GTC-GTA-GGAC-3 ′ GAC-GTC-GAC-GAC-GTC-GTA та специфічні для праймерів Smarca4 (5′-GCCTTGTCTCAAACTGATAAG-3 ′ та 5′-GTCATACTTATGTCATAGCC-3 ′ та 5′-GATCAGCTCATGCCCTAAGG-3 ′). Мишей інтенсивно контролювали двічі на день, включаючи контроль ваги та розміру.

Гістологія/імунофарбування.

Вкладену в парафін тканину секціонували, депарафінізували та регідратували перед тим, як індукований теплом пошук антигену проводили при 100 ° C протягом 20 хв у 10 м м натрій-цитратному буфері для всіх антитіл. Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням первинних антитіл (NeuN, Smarcb1, Calbindin, Cre, фосфо-Гістон H3) та системи фарбування HRP/DAB (DAKO) відповідно до технічних вимог виробника. Гемалоун використовувався для ядерного фарбування. Для імунофлуоресцентних подвійних фарбувань зрізи двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100 і потім інкубували в блокувальному буфері (блокуючий реагент на основі білка I-Block; Applied Biosystems) протягом 30 хв. Первинні антитіла розводили в блокувальному буфері і застосовували протягом ночі при 4 ° С. Далі тканину двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100 і інкубували ще 60 хв з розведенням мічених флуоресценцією вторинних антитіл (козяча анти-миша Alexa546; козяча проти кролика Alexa488, Invitrogen) для блокування буфер. Зрізи двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100, фарбували 4 ', 6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI) і встановлювали у флуоресцентному монтажному середовищі (DAKO). Всі зображення зрізів тканин були зібрані на мікроскопі Olympus IX50 у поєднанні з системою кольорового зображення Soft Imaging System.

Культура клітин.

Культури попередників нейронів мозочкових гранул були створені, як описано раніше (Lorenz et al., 2011). Коротко кажучи, мозочок післяпологових цуценят 5-го дня (P5) виймали і готували в HBSS (Invitrogen) з додаванням глюкози. Оболонки мозку та тканини сплетення були обережно видалені. Дисоціація об’єднаного мозочка була спричинена трипсином-ЕДТА-ДНКазою. HBSS замінили культуральним середовищем, що містить DMEM-F12 (Invitrogen), 25 м м KCl, добавку N2 (Invitrogen), пеніцилін-стрептоміцин (Pen-strep) та 10% фетальної телячої сироватки (FCS) (Sigma). Після центрифугування клітини висівали при концентрації 3 млн./Мл у лунки, покриті полі-1-орнітином (Sigma), та інкубували при 37 ° С протягом 6–12 год для відновлення. Потім середовище замінили на безсироваткове культуральне середовище, що містить Shh-білок (R&D Systems) у концентрації 3 мкг/мл.

Виробництво вірусів IRES-GFP та Cre-IRES-GFP проводилось, як було опубліковано раніше (Lorenz et al., 2011). Коротко, 293 пакувальні клітини (Invitrogen) вирощували в DMEM-10% FCS-Pen-strep-300 мкг/мл G418 і трансфікували по 10 мкг кожної вірусної конструкції, а також vsv-g та gag-pol плазміди, використовуючи Реагент для трансфекції Fugene 6 (Roche). Вірус, що містить середовище (без G418), збирали кожні 24 год протягом 3 днів поспіль, об’єднували, фільтрували та зберігали при -80 ° C до використання.

Для експериментів, показаних на малюнку 2, клітини сортували FACS на основі експресії GFP, використовуючи FACS ARIA III (BD Bioscience). Після сортування FACS клітини замінювали з щільністю 3 млн./Мл у лунки, покриті полі-1-орнітином (Sigma), та інкубували при 37 ° C протягом 6–12 год для відновлення. Ці клітини нарешті використовувались для експериментів з підрахунку клітин [з використанням камери Нойбауера та автоматизованого лічильника клітин TC10 (Bio-Rad)] та для аналізу РНК.

Екстракція нуклеїнової кислоти та аналіз ПЛР.

Кількісні показники та статистика.

Аналіз фенотипів умовних нокаутованих мишей проводили щонайменше для трьох мишей кожного генотипу та кожного віку, які були взяті з різних послідів.

Мутації SMARCA4, хоча і рідко, також можна виявити в AT/RT людини, і ми поставили під сумнів питання про те, чи призвела делеція Smarca4 до попередників клітин мозочкових гранул утворення пухлини. Як показано на малюнку 1, V – EE, це було не так, і миші Math1-cre: Smarca4 fl/fl демонстрували фенотип, який дуже нагадував зміни, помічені у мишей Math1-cre: Smarcb1 fl/fl, як щодо гістоморфологічних особливостей, так і експресії NeuN та Кальбіндіну.

Втрата Smarcb1 призводить до серйозних дефіцитів проліферації попередників гранульованих нейронів та активації сигналізації Wnt

Втрата Smarcb1 погіршує проліферацію та активує передачу сигналів Wnt у попередниках клітин мозочкових гранул. Попередники клітин мозочкових гранул були виділені від мишей Smarcb1 fl/fl у день P5, культивовані та трансдуковані вірусами IRES-GFP або Cre-IRES-GFP. Через тридцять шість годин після трансдукції клітини сортували на GFP-позитивні клітини та проводили експерименти. Клітини, трансдуйовані Cre-IRES-GFP, демонстрували сильне зниження експресії Smarcb1, як очікувалося (A). Крім того, розповсюдження значно зменшилось (B), а клітини в умовах Cre-IRES-GFP характеризувались масивною регуляцією генів-мішеней Wnt Tcf4, Lef1, Dkk1 та Axin2. Істотних змін щодо експресії Ink4a, Gli1, Gli2, Gli3 або Cyclin D1 не спостерігалося (C.).

Відсутність пухлин головного мозку після широкомасштабної втрати Smarcb1 у hGFAP-позитивних нейронних попередниках

Втрата Smarcb1 у hGFAP-позитивних клітинах-попередниках аналогічним чином призводить до гіпопластичної мозочка, але не до утворення пухлини мозку. Ріст мозочків у hGFAP-cre: Smarcb1 fl/fl різко знизився порівняно з контролем (плями H&E сагітально порізаного мозку; A, B проти Е, F) з відсутністю листяного покриву та кортикального шарування (C., D проти G, H). Більше того, ми виявили серйозні порушення ламінації та витончення кори головного мозку (A проти Е), що вказує на те, що Smarcb1 так само важливий для розвитку переднього мозку. Шкала шкал: A, Е, 2 мм; B, 500 мкм; F, 300 мкм; C., D, G, H, 100 мкм.

Обговорення

Тут ми показуємо, що втрата Smarcb1 та Smarca4 призводить до серйозних дефіцитів проліферації попередників гранульованих нейронів та гіпопластичного мозочка. Отже, Smarcb1 та Smarca4 виконують проліферативну роль у попередниках нейронів гранул мозочка. Подібні проліферативні функції SMARCA4 були виявлені в ембріональних стовбурових клітинах (Ho et al., 2011). В іншому дослідженні миші Smarcb1 inv/inv померли через важку недостатність кісткового мозку, що може бути пов'язано з недостатністю проліферації гемопоетичних стовбурових клітин (Roberts et al., 2002). Разом ці результати показують, що SMARCB1 та SMARCA4 явно виконують різноманітні функції, які можуть бути типовими для клітин та/або специфічними для часу.

Окрім залучення їжака Sonic (Jagani et al., 2010) та сигналізації бегемота (Jeibmann et al., 2014), було показано, що рабдоїдні пухлини демонструють змінену сигналізацію Wnt (Mora-Blanco et al., 2014). Наші результати попередників гранулярних клітин дозволяють припустити, що Smarcb1 призводить до дерегуляції сигналізації Wnt/β-катеніну, яка, здається, не залежить від контексту. На відміну від цього, раніше було показано, що втрата Smarca4, яка мала наслідки, порівняні з тими, що спричинені втратою Smarcb1, інгібує мітогенні ефекти передачі сигналів їжака Sonic у звичайних попередниках клітин мозочкових гранул (Zhan et al., 2011). Одночасно було описано передачу сигналів Wnt, що погіршує проліферацію попередників гранульованих нейронів та протидіє утворенню Shh-асоційованої медуллобластоми (Pöschl et al., 2014b). Отже, наші дані сумісні зі сценарієм, коли втрата білків Smarc інгібує Shh-проліферацію попередників клітин мозочкових гранул через регуляцію сигналів Wnt.

Виноски

Цю роботу підтримали Німецька програма протидії раку (Max-Eder-Programm), Else-Kröner-Fresenius-Stiftung та Wilhelm Sander Stiftung (всі для США); та МВФ Мюнстер, IZKF Мюнстер та Фонд Соні Васович (усі - К.К.). Ми винні М. Шмідту за експертну технічну допомогу. Ми вдячні Чарльзу Робертсу (Інститут раку Дани Фабер, Бостон) за надання мишей Smarcb1 fl/fl та П'єру Шамбону (IGBMC, Illkirch-Graffenstaden, Франція) за надання мишей Smarca4 fl/fl.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.