Вплив протигрибкового лікування на дієтичній моделі мишей дисемінованого кандидозу, придбаного через шлунково-кишковий тракт

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

Candida albicans, найчастіше ізольований людський грибковий збудник, становить близько 50% випадків кандидозу і може спричинити широкий спектр системних інфекцій слизових та небезпечних для життя людей (1, 2). Особи з ослабленим імунітетом, включаючи хворих на ВІЛ/СНІД, одержувачів протезів, хворих на рак та реципієнтів трансплантованих органів, особливо вразливі до інфекції (3–6). Близько 70% хворих на тверду пухлину розвивають інфекції Candida, багато з яких або отримували хіміотерапію та/або перенесли операцію за місяць до зараження (7). Кандидоз також є основною причиною смерті серед хворих на лейкемію (7, 8). Щорічно лише на лікування пацієнтів із госпітальною інфекцією Candida витрачається приблизно 1 млрд. Доларів США (9).

Також було встановлено ряд моделей для коменсальної колонізації тракту ШКТ C. albicans (16, 26–31). Інокуляцію, як правило, проводять орально, а колонізацію контролюють, визначаючи грибкове навантаження у фекальних гранулах у різні моменти часу постінокуляції. Деякі з цих моделей були дуже корисними для характеристики транскрипційних регуляторів, таких як Efh1 та Sfu1, які беруть участь у контролі рівня колонізації C. albicans ШКТ у відповідь на екологічні сигнали господаря. Однак одним з обмежень цих моделей є те, що для досягнення колонізації C. albicans використовуються антибіотики, які можуть впливати на рівень і склад природної бактеріальної флори.

Для вирішення цього питання Ямагучі та ін. описав модель ГІ миші, яка використовує очищений раціон, що складається з кукурудзяного крохмалю, казеїну, сахарози, соєвої олії, целюлози, 1-цистину, холіну бітартрату, а також вітамінно-мінеральних сумішей, а не стандартну комерційну дієту (32). Очищена дієта призводить до зниження рівня лактобактерій в кишечнику, а також до зменшення кількості органічних кислот, які виробляють ці бактерії. Органічні кислоти, у свою чергу, раніше, як було показано, інгібують ріст C. albicans. Крім того, попереднє дослідження показало, що комерційні дієти для гризунів містять речовини, які нейтралізують токсичність жирних кислот проти лактобактерій (33), підвищуючи тим самим рівень цих бактерій (і, швидше за все, також підвищуючи рівень органічної кислоти в кишечнику). Таким чином, очищена дієта полегшує C. albicans початкову колонізацію шлунково-кишкового тракту без додаткових ускладнень при застосуванні антибіотиків.

У цьому дослідженні ми модифікуємо дієтичний підхід, описаний вище, для розробки нової моделі миші, яка може бути спеціально використана для дослідження дисемінованого кандидозу, придбаного через шлунково-кишковий тракт. Ми демонструємо, що наша модель може оцінити як смертність, так і колонізацію шлунково-кишкового тракту, а також розповсюдження грибів на різні системні органи при імуносупресії. Найголовніше, ми показуємо, що цю модель можна використовувати для визначення ефективності множинних протигрибкових препаратів для зупинки поширення C. albicans із шлунково-кишкового тракту.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Процідити. C. albicans SC5314 був штамом, що використовувався в цьому дослідженні, який був раніше описаний (34). Ми використовували штам SC5314, оскільки це найбільш часто використовуваний штам C. albicans дикого типу та еталонний штам, з якого отримано більшість інших штамів C. albicans, що дозволяє краще порівняти наші результати з результатами інших досліджень. Крім того, вірулентність цього штаму оцінювалась у численних попередніх дослідженнях (11, 35, 36). C. albicans SC5314 виділяли із запасів гліцерину при -80 ° C і вирощували на дріжджових екстрактах-пептон-декстрозі (YEPD) при 30 ° C протягом 2 днів. Потім клітини використовували для інокуляції 50 мл рідкого середовища YEPD, і культуру вирощували протягом ночі (~ 16 до 24 год) при 200 об/хв в інкубаторі з температурою 30 ° C перед підготовкою інокуляту.

(ii) Аналіз виживання. Експерименти з виживання проводили способом, ідентичним такому для експериментів з розповсюдження, описаних вище, з використанням інокуляту клітин 4,2 × 10 7 C. albicans, за наступними винятками: (i) чотири дози лікування імуносупресією, кожна із 150 мг/кг циклофосфаміду (ip) та 65 мг/кг преднізолону (sc) вводили на 14, 17, 21 та 24 дні після інфікування, і (ii) моніторинг виживаності протягом 30 днів, і всіх вижилих мишей приносили в жертву на день 30. Грибкове навантаження на печінку, нирки, селезінку, лісомахи та тонку кишку оцінювали, як описано вище для аналізу розповсюдження.

Цей протокол для тварин був затверджений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Техаському науковому центрі охорони здоров'я в Сан-Антоніо, і всі тварини утримувались відповідно до Асоціації з оцінки та акредитації лабораторних доглядів за тваринами.

РЕЗУЛЬТАТИ

Схема дієтичних моделей кандидозу, придбаних через шлунково-кишковий тракт. (А) Контур моделі, що використовується для оцінки поширення C. albicans із шлунково-кишкового тракту. Мишей поміщали на очищену дієту AIN-93G на 2 тижні, а потім інокулювали пероральним втручанням (внутрішньошлункове щеплення [наприклад,]) штамом C. albicans дикого типу. Через додаткові 2 тижні одній групі мишей вводили дві дози імунодепресивного лікування, а другій контрольній групі імунодепресивний стан не проводили. Всіх мишей забивали через 21 день після інфікування, а шлунково-кишкові та системні органи збирали для аналізу грибкового навантаження. (B) Контур моделі, що використовується для оцінки виживання у відповідь на шлунково-кишкову дисемінацію C. albicans. Дотримувались протоколу, подібного до описаного вище для панелі А, за винятком того, що мишам вводили чотири дози імунодепресивного лікування та контролювали їх виживання протягом 30 днів. Всіх вижилих мишей забивали на 30 день. ГРП, 5 мг/кг флуконазолу (i.p.); CSP, 1 мг/кг каспофунгіну (внутрішньовенно); Цикло, 150 мг/кг циклофосфаміду (ip); Pred suc, 50 мг/кг преднізолону натрію сукцинату (Solu-Delta-Cortef) (s.c.); Pred, 65 мг/кг преднізолону (s.c.); пре, преімуносупресія; пост, постімуносупресія; D0, день 0.

Флуконазол та каспофунгін пригнічують розповсюдження C. albicans із шлунково-кишкового тракту господаря з ослабленим імунітетом. Мишей заражали 6 × 10 7 клітинами штаму C. albicans дикого типу, вводили протигрибкові засоби, пригнічували імунітет та жертвували, як описано в легенді на фіг. 1А. (A) Середнє грибкове навантаження (± стандартні похибки засобу) у фекаліях зазначених груп мишей, взятих у показані моменти часу. (B) Грибкове навантаження в органах шлунково-кишкового тракту від зазначених груп мишей, принесених у жертву в зазначені моменти часу (стовпчики вказують медіани) (n = 5 [інфіковані групи на день 14 або день 21] або n = 10 [усі інші групи]). (C) Грибкове навантаження в системних органах від зазначених груп мишей, принесених у жертву у зазначені моменти часу (стовпчики вказують медіани) (n = 5 [інфіковані групи на день 14 або день 21] або n = 10 [усі інші групи]). У неінфікованої групи грибкове навантаження не спостерігалось. CSP, 1 мг/кг каспофунгіну; ГРИП, 5 мг/кг флуконазолу; Імуно, з ослабленим імунітетом.

Поширення C. albicans із шлунково-кишкового тракту зменшує виживання імунодефіцитного господаря. Мишей заражали 4,2 × 10 7 клітин штаму C. albicans дикого типу, як описано в легенді на фіг. 1B. Чотири послідовні дози циклофосфаміду (150 мг/кг) та преднізолону (65 мг/кг) вводили як інфікованим, так і неінфікованим контрольним групам у зазначені часові моменти (стрілки вниз), і виживаність контролювали протягом 30 днів (n = 9 [ заражена група] або n = 10 [незаражена група]). На основі аналізу логарифмічного рейтингу ми спостерігали статистично значущу різницю між зараженими та неінфікованими групами (Р = 0,0002).

ОБГОВОРЕННЯ

Основною перевагою моделі GI миші для дисемінованого кандидозу, яку ми розробили в цьому дослідженні, є те, що початкова колонізація досягається за допомогою очищеної дієти, а не антибіотиків. Дієтичний підхід призводить до зниження вмісту органічних кислот в шлунково-кишковому тракті (порівняно з рівнями, що спостерігаються при використанні комерційних дієт), що сприяє зростанню C. albicans і зменшує ріст конкуруючої бактеріальної флори (32). Оскільки C. albicans зазвичай зустрічається як комменсал шлунково-кишкового тракту ссавців у здорових людей, підхід, заснований на дієті, швидше за все, забезпечує кращу апроксимацію природного середовища кишечника людини. Наш висновок про те, що імунодепресія, як видається, має більший вплив на системне грибкове навантаження порівняно з органами шлунково-кишкового тракту, також суттєво свідчить про те, що збільшення системного грибкового навантаження, яке ми спостерігали під час імуносупресії, в основному відбулося внаслідок збільшення транслокації C. albicans через шлунково-кишковий тракт ( тобто не є опосередкованим наслідком збільшення грибкового навантаження в ШКТ). Однак одним з обмежень нашого дослідження є те, що був використаний лише один ізолят C. albicans. У майбутніх дослідженнях буде цікаво перевірити точність нашої моделі за допомогою кількох ізолятів.

ПОДЯКИ

Ми вдячні Арлін Фаріас за допомогу з моделями тварин, а також Моуа Банерджі за технічну підтримку. Ми також дякуємо членам Центру медичної мікології Сан-Антоніо, а також Скотту Філлеру, Ашрафу Ібрагіму та Рорі Дункану за їх корисні поради та пропозиції.

Вміст несе відповідальність виключно авторів і не обов'язково відображає офіційні погляди Національного інституту алергії та інфекційних хвороб або Національного інституту охорони здоров'я.