Вплив дієти в їдальні та щоденних фізичних тренувань на метаболом сироватки щурів

Афілійований департамент Bioquímica i Biotecnologia, Науково-дослідна група з нутрігеноміки, Університет Ровіра і Вірджилі, Таррагона, Іспанія

Партнерський технологічний підрозділ з питань харчування та здоров'я, EURECAT-Технологічний центр Каталонії, Реус, Іспанія

Афілійований Інститут нейросистеми, Департамент психіатрії та медицини, Юридичний університет Барселони, Барселона, Іспанія

Відділ біохіміки та біотехнології, Науково-дослідна група з нутрігеноміки, Університет Ровіра і Вірджилі, Таррагона, Іспанія, Технологічний підрозділ з питань харчування та охорони здоров'я, EURECAT-Технологічний центр Каталонії, Реус, Іспанія

Сусана Суарес-Гарсія,
Хосеп М. дель Бас,
Антоні Каймарі,
Роза М. Ескоріуела,
Ллуїс Арола,
Мануель Суарес

Цифри

Анотація

Цитування: Suárez-García S, del Bas JM, Caimari A, Escorihuela RM, Arola L, Suárez M (2017) Вплив дієти в їдальні та щоденних фізичних тренувань на метаболом сироватки щурів. PLoS ONE 12 (2): e0171970. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171970

Редактор: Гільєрмо Лопес Луч, Університет Пабло де Олавіде, ІСПАНІЯ

Отримано: 22 вересня 2016 р .; Прийнято: 27 січня 2017 р .; Опубліковано: 13 лютого 2017 року

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Підтримку надали Міністерство економіки та конкурентоспроможності Іспанії PSI 2011-29807-C02/PSIC Роза Марія Ескоріуела, а Міністерство економіки та конкурентоспроможності Іспанії AGL2013-40707-R Люліс Арола.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Метаболічний синдром (MetS) - це комбінація метаболічних порушень, включаючи інсулінорезистентність, дисліпідемію, ожиріння та гіпертонію, яка набуває дедалі більшого поширення у нашому суспільстві через малорухливий спосіб життя та режим харчування [1–3]. Враховуючи, що цей розлад може спричинити серцево-судинні захворювання [4] та діабет ІІ типу [5], докладаються великі зусилля для запобігання його розвитку. Було показано, що фізична активність надає сприятливі ефекти, включаючи втрату ваги, зміну відсотка жиру в організмі та покращення артеріального тиску, ліпопротеїнового профілю, рівня холестерину та чутливості до інсуліну [6–8]. Зокрема у підлітків, заміна сидячих звичок, таких як багатогодинний перегляд телевізора, підвищеною фізичною активністю є основною стратегією профілактики та лікування ожиріння [9].

Деякі дослідники намагалися визначити характерні метаболітні профілі, пов'язані з ожирінням у дорослих [14] та молоді [15]. Всі ці дослідження вказують на важливість відкриття біомаркерів для ранньої діагностики, лікування та оцінки захворювань, пов'язаних із способом життя. Недавні дослідження застосовували комплексну метаболоміку для виявлення збурень метаболітів у щурів, що годувались CAF [12,16], та у дресированих гризунів [17,18]; однак спільний вплив CAF та щоденних фізичних навантажень на циркулюючий метаболом ще не досліджений.

Завданнями цього дослідження були (1) виявити нові метаболіти, що циркулюють під впливом хронічного прийому CAF у щурів, (2) з’ясувати подальші зміни в метаболомі, які можуть допомогти нам зрозуміти механізми, завдяки яким періодичні тренування надають свої корисні (або згубні) ефекти у молодих тварин (3) вивчити, чи існують відмінності між ефектами вправ низької та високої інтенсивності, та (4) перевірити, чи відрізняються ці біохімічні процеси між тваринами з або без MetS.

Наша мета була досягнута за допомогою рідинної хроматографії, поєднаної з мас-спектрометрією (LC-MS/MS), потужною технікою, дуже придатною для досліджень метаболоміки, що дозволяє ідентифікувати молекулярні зміни серед експериментальних груп. Використання порівняльної нецільової метаболоміки дозволяє ідентифікувати потенційні біомаркери та характерні метаболічні ознаки, які можуть передбачати стан здоров'я тварин.

Матеріал і методи

Хімікати

Ацетонітрил (Merck, Дармштадт, Німеччина), крижана оцтова кислота (Panreac, Барселона, Іспанія), метанол та мурашина кислота (Scharlab S.L., Барселона, Іспанія) мали високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) аналітичного класу. Надчисту воду отримували за допомогою системи Milli-Q преимущества A10 (Мадрид, Іспанія). Для мас-спектрометрії парацетамол та пірокатехол (Fluka/Sigma-Aldrich, Мадрид, Іспанія) використовувались як внутрішні стандарти в режимі позитивної (+ ESI) та негативної (-ESI) електророзпилювальної іонізації відповідно. Обидва розчиняли в метанолі при 1 мг/мл і зберігали при -20 ° C.

Тварини, дієти та тренувальні заняття

Самки щурів Спрег-Доулі масою 62 ± 2 г відлучали у віці 21–23-денного віку та утримували по 2 особи в клітці при 22 ° C з періодом світла/темряви 12 годин. Жіночих тварин відбирали, оскільки вони переносять вищу інтенсивність примусових вправ у порівнянні з самцями та активніше беруть участь у добровільному бігу на колесі [19,20]. Тварин випадковим чином розподіляли на 6 груп (n = 9–12) відповідно до дієти (ST або CAF) та інтенсивності втручання на біговій доріжці, отриманого протягом 8 тижнів: контроль-ST (CON-ST), бігова доріжка - низька інтенсивність- ST (TML-ST), бігова доріжка високої інтенсивності ST (TMH-ST), control-CAF (CON-CAF), бігова доріжка низької інтенсивності CAF (TML-CAF) або бігова доріжка високої інтенсивності CAF (TMH-CAF ).

CAF включав такі компоненти (кількість на щура/день): ST (6–10 г), бекон (8–12 г), печиво з паштетом (12–15 г) або вершковий сир (10–12 г), солодкий рулет (8–10 г), морква (6–9 г) та молоко з цукром (220 г/л; 50 мл). ST мав розподіл калорій на 24% білка, 18% жиру та 58% вуглеводів, тоді як CAF мав 10% білка, 41% жиру та 49% вуглеводів [21]. Протягом усього експерименту тварини споживали водопровідну воду та дієту, і CAF поновлювали щодня.

Тренінгові заняття виконувались, як описано раніше [13]. Коротко кажучи, щурів тренували на біговій доріжці 5 днів на тиждень протягом 30 хв. Спочатку тварин привчали до бігової доріжки (0 м/хв), і швидкість поступово збільшували, поки вона не досягла 12 м/хв у TML та 17 м/хв у групах TMH. Ці значення зберігалися до кінця експерименту. Для мотивації тварин не використовувались ні електричний удар, ні фізичне спонукання. Контрольні щури залишались на біговій доріжці (0 м/хв) протягом еквівалентної кількості часу, як дресировані щури.

Тварин голодували протягом 12 годин, а потім жертвували головою, щоб уникнути втручання в метаболом, що циркулює, через наркотики. Загальну кров збирали і сироватку отримували центрифугуванням при 2000 g протягом 15 хв через 1 год при кімнатній температурі.

Заява про етику

Усі процедури були затверджені Генералітатом Каталонії (DAAM 6836) і виконувались відповідно до Директиви Ради Європейських Співтовариств (86/609/ЄЕС).

Визначення ліпідів, гормонів та цитокінів у сироватці крові

Для визначення тригліцеридів, загального холестерину (QCA, Барселона, Іспанія) та холестеролів ліпопротеїдів високої та низької щільності (HDLc та LDLc; Spinreact, Жирона, Іспанія) використовували ферментні набори. Лептин, адипонектин, С-реактивний білок (CRP) (Millipore, Барселона, Іспанія) та моноцитарний хемоаттрактант-білок-1 (MCP-1) (Thermo Fisher Scientific, Пітсбург, США) вимірювали за допомогою наборів ІФА щурів. Рівні іризину визначали за допомогою набору ELISA для людини/щура/миші (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Бурлінгейм, Каліфорнія, США).

Підготовка зразка до аналізу метаболоміки

Метаболіти екстрагували із сироватки за допомогою гідроалкогольного розчину. 800 мкл метанолу: води (8: 1 об./Об.) Додавали до 100 мкл сироватки, а 50 мкл пірокатехолу (1 ppm) і 50 мкл парацетамолу (1 ppm) додавали як внутрішні стандарти. Суміш гомогенізували вихровим (30 с) і ультразвуковим обробкою (30 с). Потім зразки інкубували на льоду протягом 10 хв для осадження білків і центрифугували при 19 500 г протягом 10 хв при 4 ° С. Супернатант збирали і сушили під струменем азоту для усунення розчинника. Нарешті, висушені зразки перед ін’єкцією повторно розчиняли в 200 мкл метанол: вода (8: 1 об./Об.).

LC-MS та LC-MS/MS аналіз

Для цілеспрямованого аналізу екстракти вводили в серію UHPLC 1290, з'єднану з Q-TOF 6550, також від Agilent Technologies, що працювали в режимах MS або MS/MS. Аналізи LC-MS/MS проводили, використовуючи ті самі аналітичні умови, що описані вище. Дані збирали в діапазоні m/z 100–1000 із швидкістю сканування 1,5 спектру/с. Спектри MS/MS метаболітів були отримані за різних енергій зіткнення (10, 20 та 40 еВ).

Нецільова обробка даних та ідентифікація метаболітів

Всі програми, що використовуються для обробки даних, також були від Agilent Technologies. Нецільові дані були отримані за допомогою збору даних MassHunter, тоді як якісний аналіз був використаний для отримання молекулярних особливостей зразків за допомогою алгоритму 'Molecular Feature Extractor', який видаляє фонові іони та групує пов'язані іони в унікальній функції, заснованій на наявності аддуктів та димери, розподіл ізотопів та оболонка зарядового стану. Mass Profiler Professional був використаний для вирівнювання характеристик, присутніх на хроматограмах, та для проведення багатовимірного статистичного аналізу. Дані кожного режиму іонізації, позитивного та негативного, аналізували окремо. Був отриманий список хімічних утворень, і для подальшого хемометричного аналізу були обрані лише ті ознаки, що мають мінімум 2 споріднених іона. Кілька станів заряду не враховувались. Час утримання та вікно маси, що використовувались для вирівнювання, становили 0,5% ± 0,15 хв та 10,0 ppm ± 2,0 мДа, відповідно. Значення достатку, що відповідають кожному об'єкту, були перетворені в логарифм базису-2 та нормалізовані до внутрішнього стандарту. Непоширені ознаки відкидали, і відбирали лише ті, які були виявлені принаймні в 75% зразків тієї самої групи.

Одновимірний статистичний аналіз

Тварин розподілили на 6 груп (n = 9–12) залежно від режиму харчування та тренувань: дієта стандартного контролю (CON-ST), дієта на біговій доріжці із низькою інтенсивністю (TML-ST), дієта на біговій доріжці із високою інтенсивністю (TMH-ST), дієта з контрольним кафетерієм (CON-CAF), дієта для їдальні з низькою інтенсивністю на біговій доріжці (TML-CAF) та дієта для їдальні з високою інтенсивністю на біговій доріжці (TMH-CAF). Дієти та тренувальні заняття розпочалися після періоду відлучення і були продовжені на 8 тижнів. Концентрацію ліпідів у сироватці крові визначали наприкінці експерименту через 12 год голодування. Дані подані як середнє значення ± SEM. Статистичне порівняння між групами проводили за допомогою дво- та одностороннього ANOVA. D: ефект дієти; Е: ефект від вправи; DxE: взаємодія між двома основними факторами. abc Середні значення з різними малими літерами вказують на суттєві відмінності між групами (односторонній ANOVA і постконтрастний контраст Т3 Даннета, p Рис. 2. Рівень гормонів у циркуляції, пов'язаних із захворюваннями, пов'язаними із способом життя.

Тварин годували стандартною чау (ST) або дієтою в кафетеріях (CAF) протягом 2 місяців і періодично навчали на біговій доріжці з різною інтенсивністю (CON: 0; TML: 12; TMH: 17 м/хв). Рівні адипонектину, лептину та іризину в сироватці крові визначали в кінці експерименту через 12 год голодування. Дані подані як середнє значення ± SEM (n = 9–12). Статистичне порівняння між групами проводили за допомогою дво- та одностороннього ANOVA. D: ефект дієти; Е: ефект від вправ. abc Середні значення з різними малими літерами суттєво відрізнялися (односторонній ANOVA та постконтрастний контраст T3/Tukey/Dunnett's, p Рис. 3. Циркулюючі маркери запалення.

Тварин годували стандартною чау (ST) або дієтою в кафетеріях (CAF) і навчали 5 днів на тиждень протягом 30 хв на біговій доріжці з різною інтенсивністю (CON: 0; TML: 12; TMH: 17 м/хв). Дієти та тренінги тривали протягом 8 тижнів. В кінці експерименту визначали сироваткові рівні хемоаттрактантного білка-1 (MCP-1) та С-реактивного білка (CRP) у моноцитах цитокінів. Дані подані як середнє значення ± SEM (n = 9–12). D: ефект дієти; E: ефект вправи (p Рис. 4. Діаграми Венна, що показують кількість значущих сутностей від кожного експериментального параметра.

Дані кожного режиму іонізації, позитивні та негативні, аналізували за допомогою двосторонньої ANOVA. Для обробки коефіцієнтів неправдивих виявлень при багаторазових порівняннях, граничну точку значущості розраховували згідно з корекцією Бенджаміні-Хохберга на рівні 5%. D: ефект дієти; Е: ефект від вправи; DxE: взаємодія між двома основними факторами. Області, де кола перекриваються, показують кількість значущих сутностей, спільних для параметрів.

Екстракти сироватки аналізували за допомогою LC-ESI-MS як в режимах позитивної, так і негативної іонізації. (A, D) Зображення теплової карти ієрархічного скупчення значущих сутностей, виявлених у кожній групі тварин. Кожен рядок являє собою точну масу, забарвлену її інтенсивністю в достатку, нормалізовану до внутрішнього стандарту та базову лінію до середнього значення всіх зразків. Шкала від -10 (синій) до +10 (червоний) представляє цю нормовану кількість в довільних одиницях. Графіки PCA (B, E) та PLS-DA (C, F) показують, що вплив дієти в їдальні переважав над періодичним тренуванням на біговій доріжці з різною інтенсивністю. Скорочення: ST, стандартна чау; CAF, дієта кафетерію; CON, контрольні тварини; TML, бігові доріжки з низькою інтенсивністю бігунів; TMH, бігові доріжки високої інтенсивності.

Метаболіти, пов’язані з вживанням дієти в кафетеріях.

Визначивши сутності, які були істотно модифіковані дієтою, було проведено попереднє виявлення їх природи. Ця ідентифікація була проведена за допомогою LC-ESI-MS/MS, використовуючи порівняння точної маси, часу утримання та спектральної та фрагментаційної інформації з даними у базах даних метаболітів (Таблиця 1). Результати вказують на те, що CAF змінив рівні семи з восьми категорій ліпідів, включених до LIPID MAPS: гліцерофосфоліпіди, головним чином лізофосфатидилхоліни (Lyso-PC); сфінголіпіди та гліцероліпіди, обидва збільшені у тварин, що харчуються CAF; стерини, такі як жовчні кислоти, ліполіди пренолу, включаючи похідні вітаміну Е та ретиноїди, та флавоноїд, названий еквол, який належить до категорії полікетидів, - все зменшилось після хронічного прийому CAF; і категорія жирних ацилів, що складається з ненасичених вільних жирних кислот та ацилкарнітинів, які відповідно зменшувались і збільшувались у сироватці крові тварин, що годували CAF. Лізо-ПК був найбільш представленою родиною, на яку впливали дієти з неоднорідною регуляцією у відповідь на годування CAF.

Зміни метаболому, пов’язані з фізичними навантаженнями.

Зосередившись на метаболітах, на які фізичні вправи мали значний вплив, було виявлено чотири біомаркери (рис. 6A, 6B, 6D та 6E). З них три були безпосередньо модифіковані фізичними вправами (ретиноїл глюкуронід, лізофосфатидилетаноламін та жовчна кислота), оскільки їх сироваткові концентрації суттєво знижувались із практикою бігу як на щурах, що годувались ST, так і на CAF. Виявлено значну взаємодію між дієтою та фізичними вправами для рівнів стеароїлкарнітину, які були значно нижчими у щурів TML-CAF порівняно з групами CON-CAF та TMH-CAF (рис. 6D).