Вплив 8-тижневої дієтичної добавки мікроелементів на експресію генів у елітних гандбольних спортсменів

Співпрацювали в цій роботі з: Хорхе Моліна-Лопес, Марією Антонієтою Квіспе Рікальде, Базіліо Вальядаресом Ернандесом, Оленою Планеллс

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, дослідження, методологія, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Філіалістичний факультет, Фармацевтичний факультет, Університет Гранади, Гранада, Іспанія, Інститут харчування та харчових технологій, Центр біомедичних досліджень, Технологічний парк наук про здоров'я, Університет Гранади, Гранада, Іспанія

Ролі Концептуалізація, курація даних, дослідження, методологія, ресурси, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Інститут тропічних хвороб та охорони здоров'я Канарських островів, Університет Ла-Лагуна, Ла-Лагуна, Тенеріфе, Канарські острови, Іспанія

Дослідження ролей, методологія, ресурси, нагляд, написання - огляд та редагування

Ролі Збір даних, Формальний аналіз

Authors ‡ Ці автори також внесли однаковий внесок у цю роботу.

Підрозділ соціальних досліджень оборони, Генеральний технічний секретар, Міністерство оборони, Мадрид, Іспанія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз

Authors ‡ Ці автори також внесли однаковий внесок у цю роботу.

Афілійоване управління статистики. Факультет соціально-правових наук Університету Карлоса III, Хетафе, Мадрид, Іспанія

Дослідження ролей, методологія, ресурси, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Хорхе Моліна-Лопес,
Марія Антонієта Квіспе Рікальде,
Базіліо Вальядарес Ернандес,
Антоніо Планеллс,
Роберто Отеро,
Олена Планеллс

Цифри

Анотація

Призначення

Було проведено дослідження змін у експресії генів у елітних гандбольних спортсменів, порівняно модуляцію генів до, після та за відсутності 8-тижневого втручання з полівітамінами/мінеральними добавками.

Методи

Було включено 13 елітних гандбольних спортсменів (у віці 22,9 ± 2,7 року) та 13 сидячих контролерів (у віці 20,9 ± 2,8 років). Було встановлено три часові точки: T0 (базові умови); Т8 (після 8 тижнів прийому добавок полівітамінним/мінеральним комплексом); і Т16 (через 8 тижнів за відсутності добавок). Експресію загальної кількості 112 генів оцінювали за допомогою RT-qPCR-аналізу за допомогою ПЛР-системи QuantStudioTM 12K Flex у реальному часі.

Результати

Аналіз виявив різні профілі генної регуляції генів, залучених до клітинної комунікації, енергетичного обміну клітин, запалення та імунної системи, окисного стресу та функції м'язів у спортсменів порівняно з сидячим контролем в умовах спокою (регульовані гени: розмір ефекту = великий, ƞ2 = 1,011 до 1.398, с Таблиця 1. Зміст щотижневих тренувань у гандболістів.

Критеріями включення були: проходження медичного обстеження набору, яке складалося з клінічного обстеження, оцінки історії хвороби, статусу некурця та відсутності вживання ліків. Критеріями виключення були: споживання будь-яких харчових добавок за 6 тижнів до і під час дослідження, а також відсутність бажання брати участь у дослідженні. Дослідження було схвалено Комітетом з етики Університету Гранади та проведено відповідно до Гельсінкської декларації. Ціль дослідження та можливі ризики та дискомфорт були пояснені учасникам до отримання їх письмової згоди. Дослідження було зареєстровано в Національному інституті охорони здоров’я США (ClinicalTrials.gov) NCT03672786. Назва: Експресія генів у втручаються спортсменів.

Експериментальний дизайн

SED = сидячий контроль; РУКА = Елітні гандболісти.

Характеристика учасника

Забір крові та виділення та кількісне визначення РНК

Учасники звітували в лабораторію в понеділок вранці між 8:00 та 10:00 після утримання від фізичних вправ принаймні протягом 24 годин. Після періоду спокою в лежачому положенні 10 хвилин, зразки венозної крові відбирали з антекубітальної вени за допомогою стандартних методик. Зокрема, зразки збирали у спеціальні пробірки (проби РНК крові РАХген, Бектон Дікінсон, Німеччина) для визначення експресії РНК і зберігали при -80 ° C до аналізу.

РНК-пробірки крові PAXgene інкубували протягом двох годин при кімнатній температурі, щоб досягти повного лізису клітин крові. Потім 2,5 мл цільної крові людини в пробірках РНК крові PAXgene центрифугували протягом 10 хвилин при 5000 g. Після центрифугування надосадову рідину викидали і гранулу промивали 4 мл води без РНКази, перемішували на вихрі і центрифугували протягом 10 хвилин при 5000 g. Після промивання гранулу розчиняли у 350 мкл ресуспендованого буфера та інкубували з 300 мкл зв’язуючого буфера та 40 мкл протеїнази К протягом 10 хв при 55 ° С у шейкер-інкубаторі. Лізат переносили у колонку для подрібнення PAXgene і центрифугували при 18000 g протягом трьох хвилин. Проточну фракцію змішували з 350 мкл етанолу і переносили у спінову колонку РНК PAXgene. Після промивання колонки промивним буфером 1 зразки інкубували з 10 мкл ДНКази I протягом 15 хвилин. Спінові колонки PAXgene РНК промивали промивним буфером і РНК елюювали 40 мкл буфера елюції. Ефективність лікування ДНКазою оцінювали в RT-негативних зразках.

Вихід РНК оцінювали шляхом вимірювання поглинання при 260 нм у спектрофотометрі NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Чистоту РНК розраховували із співвідношення поглинання при 260 нм та 280 нм. Співвідношення OD 260/280 становило від 1,9 до 2,2 для всіх зразків. Цілісність РНК оцінювали за допомогою наноаналізу Eukaryote Total RNA Nano на біоаналізаторі Agilent 2100 (Agilent Technologies). Якість РНК оцінювали відповідно до числа цілісності РНК (RIN), використовуючи 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Зразки високої якості (RIN ≥ 9) та стандартні зразки якості (RIN = 7) були включені в дослідження для забезпечення більш реалістичного підходу.

Кількісна ПЛР у реальному часі з високою пропускною здатністю (RT-qPCR)

Зворотну транскрипцію проводили із випадковими гексамерами з використанням комплекту зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США) згідно з інструкціями виробника. Два мкг загальної РНК транскрибували зворотними випадковими гексамерами з використанням комплекту зворотної транскрипції кДНК високої ємності. Умови термоциклеру встановлювали для роботи протягом двох годин при 37 ° C і протягом 10 хвилин при 75 ° C з наступним швидким охолодженням до 4 ° C.

Попереднє дослідження було проведено з метою відбору найбільш відповідних генів ведення домашнього господарства (Таблиця S3). Всього в аналіз було включено 52 гени для того, щоб визначити значення стабільності (М) та коефіцієнт варіації нормованих рівнів експресії еталонних генів за допомогою програмного забезпечення qBasePLUS (Biogazelle, Gent, Бельгія). Значення Cq кожного зразка завантажувалось у програмне забезпечення qBasePLUS у трьох примірниках, із встановленими значеннями відсікання (M 0,8) - при розмірах ефектів нижче 0,2 вважаються тривіальними [35]. Двосторонній дисперсійний аналіз дисперсії (ANOVA) використовували для визначення ефекту часу (лікування чи відсутність лікування) та взаємодії між групою часу *. Розмір ефекту оцінювали за частковим ета квадратом (η2, пояснюється частка дисперсії у результаті). Слідом за Коеном ми інтерпретували оцінені значення η2 таким чином: малі = 0,01; помірний = 0,06; великий = 0,14 [35].

Результати

Учасники

Тридцять дві особи спочатку мали право на участь у дослідженні. З них двоє, що відповідають групі контрольних груп, були виключені, оскільки вони повідомили, що вони фізично активні (S1 Рис). З 14 спортсменів, призначених для втручання, одного виключили під час спостереження через травму. У свою чергу, двох суб'єктів, що сидять, було виключено, оскільки вони не дотримувались полівітамінних/мінеральних втручань, а одного учасника виключили через проблеми із тимчасовим зобов'язанням. Таким чином, 13 елітних гандбольних спортсменів та 13 сидячих контролів були остаточно залучені до дослідження.

В середньому елітні гандбольні спортсмени поглинали значно більше енергії, ніж сидячі контролі (2974,5 ± 211,1 проти 2177,4 ± 488,1 Ккал; р 1,5 при базових умовах у спортсменів. Окремий порівняльний t-тест для незалежних зразків, що враховує спортсменів та сидячий контроль, показав, що ITGB1, IL6R, MAPKAPK2, ACVR1B та SOD2 повинні бути регульовані у спортсменів в умовах відпочинку (розмір ефекту = великий; ƞ2 = 1,011-1398; p 1,5, це не було статистично значущим для груп.

Порівняння моделей експресії генів після полівітамінних/мінеральних втручань

Рис.2 показує коливання в часі рівнів РНК, що відповідають 78 аналізованим генам, а також генам, що демонструють суттєві відмінності протягом періоду дослідження. Спортсмени продемонстрували тенденцію до регуляції деяких ключових генів у момент часу T8 порівняно з сидячим контролем. На відміну від цього, гандбольні спортсмени продемонстрували тенденцію до зниження експресії при Т16, тоді як контролі демонстрували більшу мінливість реакції експресії генів у той самий момент часу.

Відносні складчасті зміни рівнів РНК 78 генів у сидячому контролі (A) та гандболістах (B) після 8 тижнів полівітамінних/мінеральних втручань (сині лінії - T8) та через 8 тижнів за відсутності втручання у харчування (зелені лінії - T16 ).

Процентні зміни рівнів РНК, що відповідають 78 генам, проаналізованим в сидячому контролі, порівняно з вихідними значеннями не були значущими ні в часовій точці Т8, ні в часовій точці Т16 (медіана варіації при Т8 та Т16: 1,61% та 6,33% відповідно) (Рис.3). У випадку з гандбольними спортсменами загальна відповідь генів не показала значних змін при Т8 (медіана варіації при Т8: 1,97%). Однак загальний аналіз експресії генів від вихідного рівня до часової точки Т16 (8 тижнів за відсутності вживання їжі) показав значне зниження (медіана варіації при Т16: -11,49%).

Відсоткові зміни в експресії генів у сидячих контрольних групах (A) та гандбольних спортсменах (B) від вихідного рівня (T0) до 8 тижнів харчового втручання (T8) та через 8 тижнів за відсутності харчових втручань (T16).

Повторні заходи ANOVA проводили для порівняння модуляції експресії генів до і після полівітамінних/мінеральних добавок та аналізу взаємодії між часом та групами. Таблиця 4 показує регуляторні профілі РНК на вихідному рівні (T0) порівняно з втручанням у їжу (T8) та через 8 тижнів за відсутності втручання в організм (T16), як у сидячих контрольних групах, так і у елітних спортсменів. Виявлено основний ефект часу для ключових генів, таких як ITGB1, PDHA2 та ACVR1B, які беруть участь у таких спортивних функціях, як енергетичний метаболізм клітин та ріст м'язів/розмір/функція тіла (ηp2 = 0,102, p Таблиця 4. Виразні регуляторні профілі РНК за групи протягом усього періоду дослідження.

Взаємодія між групами часу та часу існувала для генів спортивної продуктивності IRAK1, CD81, ITGB1, ACADS, PDHA2 та GPX1 (ηP2 = 0,070-0,092; p Рис. 4.

(A) Відсоткова зміна експресії генів для найвищих генів у гандбольних спортсменів та сидячого контролю від вихідного рівня до 8 тижнів харчового втручання (T8) та (B) через 8 тижнів за відсутності харчового втручання (T16).

Обговорення

Існує клітинна аргументація, яка передбачає, що ген ACVR1B пов’язаний із силою [41] та спринтом/силою [42] у спортсменів. Силові та силові можливості відіграють ключову роль у командних спортивних показниках, і, спираючись на наукову літературу, конкретна фізична підготовка включає силові та силові тренування, що суттєво впливають на результативність стрибків та метання, а також на фізичні протистояння в командному гандболі [43]. ACVR1B є частиною надродини TGF-β, сукупності факторів росту, які регулюють рівень експресії певних генів, причетних до росту м’язів [44]. Хоча існуюча література зосереджена на вивченні зв’язку гена ACVR1B для визначення варіацій фенотипів м’язової сили у спортсменів [41], наше дослідження покращує розуміння більш широкого профілю експресії цього гена у елітних спортсменів як відповідь на потреби фізичних вправ. На рівні клітинного зв’язку та запалення ген ITGB1 демонстрував процентну зміну між 53,9–65,2%. Відповідно до нашого дослідження, Lui et al. [11] виявив, що тренування з фізичними вправами можуть хронічно викликати зміни транскрипції в периферичній крові. Ці гени можуть мати вирішальне значення для зміни імунологічного стану у висококваліфікованих людей.

Нашою другою метою було вивчити можливу модуляцію експресії генів після дієтичного втручання, що поєднує полівітаміни та мінерали. Наші спортсмени показали максимальний ефект регулювання генів через 8 тижнів прийому добавок (Рис.2). Двома основними генами, на які вплинули зміни часу, були PDHA2 та ACADS - обидва вони беруть участь в енергетичному обміні клітин. Комплекс піруватдегідрогенази каталізує загальну конверсію пірувату в ацетил-кофермент А і СО2 і тим самим пов'язує гліколітичний шлях із трикарбоновим циклом. На сьогоднішній день деякі автори [50] припускають, що суб'єкти, які навчаються фізичним вправам, мають підвищену максимальну здатність використовувати вуглеводи в результаті збільшення експресії комплексу піруватдегідрогенази в скелетних м'язах. Так само ген ACADS є важливим для окислення жирних кислот - багатоступеневий процес, який розщеплює жири та перетворює їх в енергію. У зв'язку з цим Zoladz et al. [51] повідомили про підвищення рівня ACADS (на

приблизно 65%) в ізольованих мітохондріях від дресированих щурів. Це свідчить про те, що тренування на витривалість призводить до регуляції окислювальної здатності мітохондріальних м’язів у фізіологічних умовах. Однак варто підкреслити, що в цьому дослідженні ген ACADS здавався надмірно вираженим приблизно на 37% у спортсменів порівняно з вихідним рівнем і зниженим регулюванням приблизно на 90% після припинення дієтологічного втручання (часовий момент T16 проти часового пункту T8). Це може пояснити підвищену експресію генів, і може посилити переваги, спричинені адаптаційними змінами, пов'язаними з конкретними метаболічними та фізіологічними процесами у спортсменів [7], та позитивний ефект від добавок, що підтверджується статистичною значимістю спостережуваної групи часу * взаємодія (Таблиця 4).

Висновки

Підводячи підсумок, ми зафіксували інший профіль експресії ключових генів у клітинах крові, які беруть участь у основних спортивних функціях елітних гандболістів, порівняно з сидячим контролем. Полівітамінні/мінеральні втручання показали обмежений вплив на кілька харчових метаболічних генів. Однак втручання модулювало скоординоване підвищення чи зниження регуляції ключових генів, пов'язаних із конкретними шляхами, і могло мати значний позитивний вплив на такі спортивні функції, як мітохондріальна функція, клітинна комунікація, ріст м'язів, реакція на окислювальний стрес та гостре запалення.