Тромбопоетин і тромбін викликають фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах крові людини

  • Розділений екран
  • Поділитися піктограмою Поділіться
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Електронна пошта

  • Значок Інструменти Інструменти

    • Йосітака Міякава, Ацусі Ода, Брайан Дж. Друкер, Кацутосі Озакі, Макото Ханда, Хідея Охаші, Ясуо Ікеда; Тромбопоетин та тромбін викликають фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах крові людини. Кров 1997; 89 (8): 2789–2798. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V89.8.2789

      тромбін

      Завантажити файл цитування:

      Анотація

      Основна увага в цьому звіті приділяється протоонкогенному продукту Vav, білку на 95 кД, що в основному експресується в гемопоетичних клітинах. 10-20 Чи важливим є Vav у кровотворенні - суперечливе питання. 17-20 Однак нещодавній звіт припускає, що Vav може бути необхідним для еритропоезу дорослих. 21 Відомо, що множинні цитокіни та гемопоетичні фактори росту індукують фосфорилювання тирозину Vav. 10-16 Крім того, кілька звітів вказують на те, що Vav відіграє важливу роль у передачі сигналів через Т- і В-клітинні антигенні рецептори в лімфоїдних клітинах. 22-24

      Враховуючи наявність на тромбоцитах функціональних рецепторів тромбопоетину та існування білків від 95 до 85 кД як основних фосфорильованих білків тирозину після стимуляції тромбоцитів тромбопоетином, 2 ми дослідили, чи можуть тромбоцити мати білок Vav, і якщо він стає фосфорильованим тирозином після обробки тромбопоетин. Ми показали, що тромбопоетин викликає збільшення фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах без підвищення концентрації цитозольного іонізованого кальцію ([Ca 2+] i) або активації протеїнкінази C. Тромбін, U46619, колаген або форбол 12-міристат 13 ацетат (РМА), всі з яких, як відомо, активують протеїнкіназу С, 25 також індукують збільшення фосфорилювання тирозину Vav. Тромбін викликає перерозподіл Vav у нерозчинний залишок Triton X-100 залежно від агрегації. Нарешті, подібно до багатьох білків, включених до нерозчинного залишку Triton X-100 після агрегації тромбоцитів, таких як інтегрін β3, p60 c-src, талін та актин-зв’язуючий білок, ми виявили, що Vav є ендогенним субстратом кальпаїну, припускаючи, що Vav може відігравати роль у подіях післягрегації. 26-34

      МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

      Підготовка тромбоцитів. Кров людини у здорових добровольців відбирали шляхом венепункції в 1/10 об'єму 3,8% (мас./Об.) Тринатрієвого цитрату і обережно перемішували. Багату тромбоцитами плазму (PRP) готували центрифугуванням цільної крові при 200g протягом 20 хвилин та аспірацією PRP. PRP інкубували з аспірином (2 ммоль/л) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. PGE1 (1 мкмоль/л) додавали із вихідного розчину в абсолютному етанолі (1 ммоль/л). PRP обертали на 800 г, утворюючи м'яку гранулу тромбоцитів. Гранулу ресуспендували в 1 мл модифікованого буфера HEPES-тироду (129 ммоль/л NaCl, 8,9 ммоль/л NaHCO3, 0,8 ммоль/л KH2PO4, 0,8 ммоль/л MgCl2, 5,6 ммоль/л декстрози та 10 ммоль/л HEPES, рН 7,4), що також містить апіразу (2 ОД/мл) і промивають двічі. Тромбоцити ресуспендували в тому ж буфері при концентрації 3 × 10 8 клітин/мл за допомогою апірази (2 ОД/мл), що містить 1 ммоль/л CaCl2 при 37 ° C.

      Клітинні лінії. Тромбопоетинозалежна клітинна лінія (FDCP-hMpl5) була попередньо встановлена ​​шляхом трансформації клітин FDCP-2 експресійною плазмідою, що містить кДНК людської c-mpl у повному розмірі, керовану тривалим кінцевим повторенням вірусу саркоми миші Молоді. 3,37,38 Перед обробкою клітин реагентами їх інкубували в IMDM, що містить 10% фетальної телячої сироватки (FCS) без екзогенного інтерлейкіну (IL) -3 протягом 6 годин. Після двох промивань їх інкубували в сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS; pH 7,4).

      Імунопреципітація. Стимуляцію клітин припиняли додаванням рівної кількості буфера для лізису (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 2% Тритон Х-100 (об/об), рН 7,4). Через 20 хвилин на льоду лізати центрифугували при 10000 g (при 4 ° C) протягом 20 хвилин. Надосадову рідину видаляли та інкубували з імунною сироваткою та білком А-сефарозою (40 мкл 50% -ної суспензії) протягом 1 години. Потім додавали бажані поліклональні або моноклональні антитіла та інкубували протягом 2-3 годин на льоду. Додавали білок A-сефарозу або кон'юговану IgG агарозу (40 мкл 50% -ної суспензії) та інкубували протягом декількох годин. Імунні комплекси промивали 1 мл холодного буфера для промивання (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 1% Triton X-100 [об./Мас., РН 7,4) три рази, а потім ресуспендували в буфері зразків Леммлі.

      Виділення оперативно визначеного цитоскелета тромбоцитів. Нерозчинний цитоскелет Triton X-100 був виділений, як описано з наступною модифікацією. 36 Коротко, рівна кількість буфера для лізису (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 2% тритону Х-100 [об./Мас.], РН 7,4) додавали до суспензій тромбоцитів для солюбілізації тромбоцитів. Через 5 хвилин на льоду лізати центрифугували при 10000 г. Отриману гранулу промивали двічі промивним буфером (145 ммоль/л NaCl, 0,1 ммоль/л MgCl2, 0,5 ммоль/л PMSF, 5 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,4 мкг/мл лейпептину, 1% [ об./мас.] Тритон-Х 100, рН 7,4). Для одновимірного електрофорезу SDS нерозчинний залишок Triton X-100 розчиняли в буфері зразків SDS. Надосадову рідину розбавляли рівним об'ємом двічі концентрованого буфера зразка SDS.

      Завантаження тромбоцитів 32 Pi та аналіз фосфорильованих білків. Виявлення фосфорилювання легкого ланцюга міозину та плекстрину проводили, як описано з наступними модифікаціями. 40 Гранули м’яких тромбоцитів, приготовані, як описано вище, ресуспендували у модифікованому буфері HEPES-тироду без KH2PO4, але з апіразою (2 ОД/мл) та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Промиті тромбоцити готували, як описано вище. Лізат тромбоцитів готували та аналізували на 7,5% - 15% SDS-PAGE. 39 Гелі сушили та авторадиографували на плівках X-Omat (Eastman Kodak, Рочестер, Нью-Йорк).

      РЕЗУЛЬТАТИ

      Для визначення наявності Vav у тромбоцитах людини використовували специфічні антисироватки проти Vav. Ці антисироватки розпізнають смугу 95 кД в лізатах тромбоцитів людини, яка поєднується з смугою 95 кД в лізатах клітин Jurkat, які експресують Vav, вказуючи на те, що тромбоцити мають Vav (дані не наведені). 41-43 Як і в інших гемопоетичних клітинах, ми виявили, що Vav конститутивно асоціюється з Grb2, адаптерним білком SH2/SH3 (дані не наведені) .11,44

      Ми дослідили, чи Vav стає фосфорильованим тирозином у тромбоцитах, оброблених тромбопоетином. Тромбоцити, оброблені тромбопоетином (100 нг/мл) протягом різного часу, лізували в буфері, що містить 1% Triton X-100, і імунопреципітували специфічними антисироватками Vav. Стільки ж 95-кД білка, визнаного антисиворотками Vav, було імунопреципітовано з усіх клітинних лізатів (рис. 1А, нижня панель). Після лікування тромбопоетином цей самий білок дедалі частіше фосфорилювався тирозином на низькому базальному рівні (рис. 1А, верхня панель). Таким чином, тромбоцити мають Vav, який стає фосфорильованим тирозином після лікування тромбоцитами людини тромбоцитів. Тромбін (1 од/мл), колаген (10 мкг/мл) або U46619 (1 мкмоль/л), міметик тромбоксану, також індукують фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах (рис. 1В та С). Слід зазначити, що ми регулярно додаємо пептид RGDS (200 мкг/мл) до суспензій тромбоцитів та мінімізуємо перемішування в присутності агоністів, щоб зменшити ефекти зв’язування фібриногену з α IIbβ3 та подальшої агрегації, які суттєво впливають на фосфорилювання тирозину білка тромбоцитів.34, 45

      (А) Тромбопоетин не індукує фосфорилювання легкого ланцюга плекстрину або міозину. 32 тромбоцити, завантажені пі, стимулювали або тромбопоетином (100 нг/мл), або тромбіном (1 од/мл). Цілоклітинні лізати відокремлювали SDS-PAGE (від 7,5% до 15% гелю). Гелі сушили і авторадиографировали. Доріжки 1 і 6, тромбоцити в стані спокою; доріжки від 2 до 5, 15 секунд, 1 хвилина, 5 хвилин, 10 хвилин після додавання тромбопоетину (100 нг/мл); доріжки від 7 до 9, 15 секунд, 1 хвилина, 2 хвилини після додавання тромбіну (1 ОД/мл). Верхня стрілка вказує на взаємне розташування плекстрину; нижня стрілка, міозиновий легкий ланцюг. (B) Вплив BAPTA-AM та Ro 31-8220 на фосфорилювання тирозину Vav, індуковане тромбіном або тромбопоетином. Тромбоцити попередньо інкубували з BAPTA-AM (40 мкмоль/л) та Ro-31-8220 (10 мкмоль/л) у присутності 1 ммоль/л EGTA протягом 15 хвилин. Після інкубації до суспензії тромбоцитів додавали тромбін (1 од/мл, доріжка 2) або тромбопоетин (100 нг/мл, доріжка 3). Через 10 хвилин тромбоцити лізували додаванням рівної кількості буфера, що містить 2% Triton X-100. Фосфорилювання тирозину Vav було виявлено, як на фіг.1 (верхня панель). Ті самі мембрани PVDF, що використовувались у верхній панелі, були зняті та повторно проаналізовані для Vav (нижня панель).

      (А) Тромбопоетин не індукує фосфорилювання легкого ланцюга плекстрину або міозину. 32 тромбоцити, завантажені пі, стимулювали або тромбопоетином (100 нг/мл), або тромбіном (1 од/мл). Цілоклітинні лізати відокремлювали SDS-PAGE (від 7,5% до 15% гелю). Гелі сушили і авторадиографировали. Доріжки 1 і 6, тромбоцити в стані спокою; доріжки від 2 до 5, 15 секунд, 1 хвилина, 5 хвилин, 10 хвилин після додавання тромбопоетину (100 нг/мл); доріжки від 7 до 9, 15 секунд, 1 хвилина, 2 хвилини після додавання тромбіну (1 ОД/мл). Верхня стрілка вказує на взаємне розташування плекстрину; нижня стрілка, міозиновий легкий ланцюг. (B) Вплив BAPTA-AM та Ro 31-8220 на фосфорилювання тирозину Vav, індуковане тромбіном або тромбопоетином. Тромбоцити попередньо інкубували з BAPTA-AM (40 мкмоль/л) та Ro-31-8220 (10 мкмоль/л) у присутності 1 ммоль/л EGTA протягом 15 хвилин. Після інкубації до суспензії тромбоцитів додавали тромбін (1 од/мл, доріжка 2) або тромбопоетин (100 нг/мл, доріжка 3). Через 10 хвилин тромбоцити лізували додаванням рівної кількості буфера, що містить 2% Triton X-100. Фосфорилювання тирозину Vav було виявлено, як на фіг.1 (верхня панель). Ті самі мембрани PVDF, що використовувались у верхній панелі, були зняті та повторно проаналізовані для Vav (нижня панель).

      Цікаво, що попередні звіти вказували, що ні складні ефіри форболу, ні іонофори кальцію не викликали фосфорилювання тирозину Vav в інших типах клітин, 47,48, підвищуючи ймовірність того, що пізніший шлях може бути унікальним для тромбоцитів. Щоб оцінити можливість специфічності клітинного типу для фосфорилювання Vav тирозину, ми дослідили фосфорилювання Vav тирозину в клітинах FDCP-2, 3, що експресує c-Mpl людини (FDCP-hMPL5). Клітини FDCP-hMPL5 обробляли тромбопоетином (100 нг/мл) протягом різного часу і лізували в буфері, що містить 1% Triton X-100. Стільки ж 95-кД білка, визнаного Vav, було імунопреципітовано з клітин, що перебувають у стані спокою, і стимульованих тромбопоетином клітин (рис. 3А, нижня панель). Цей самий білок фосфорилювався тирозином після обробки тромбопоетином (100 нг/мл) (рис. 3А, верхня панель). З іншого боку, ні РМА (100 нмоль/л), ні йономіцин (20 нмоль/л) не викликали фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMPL5 (рис. 3В та С).

      Фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMpl5. (А) Індуковане тромбопоєтином фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMpl5. Клітини FDCP-hMpl5 (10 7 клітин/мл у PBS, рН 7,4) лізували додаванням рівної кількості буфера, що містить 2% Triton X-100 до та після впливу тромбопоетину (100 нг/мл) протягом різного часу як зазначено. Vav імунопреципітували специфічними Vav антисироватками. Імунні комплекси ресуспендували в буфері зразків SDS. Фосфорилювання тирозину Vav було виявлено, як описано в легенді на фіг. 1. (В і С) РМА або іономіцин не змогли індукувати фосфорилювання тирозину Vav. Лізати FDCP-hMpl5 виготовляли, як описано в (А), за винятком того, що в якості стимулятора використовували РМА (100 нмоль/л) (В) або іономіцин (20 нмоль/л) (С), де зазначено.

      Фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMpl5. (A) Тромбопоетин-індуковане фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMpl5. Клітини FDCP-hMpl5 (10 7 клітин/мл у PBS, рН 7,4) лізували додаванням рівної кількості буфера, що містить 2% Triton X-100 до та після впливу тромбопоетину (100 нг/мл) протягом різного часу як зазначено. Vav імунопреципітували специфічними Vav антисироватками. Імунні комплекси ресуспендували в буфері зразків SDS. Фосфорилювання тирозину Vav було виявлено, як описано в легенді на фіг. 1. (В і С) РМА або іономіцин не змогли індукувати фосфорилювання тирозину Vav. Лізати FDCP-hMpl5 виготовляли, як описано в (А), за винятком того, що в якості стимулятора застосовували РМА (100 нмоль/л) (В) або іономіцин (20 нмоль/л) (С).

      ОБГОВОРЕННЯ

      c-vav - клітинний гомолог v-vav онкогену. 49-52 Продукт c-vav, p95vav (Vav), переважно експресується в гемопоетичних клітинах і індукує фосфорилювання тирозину в клітинах, оброблених широким спектром факторів росту. Відповідно до попередніх звітів з використанням клітинних ліній, 53-56, ми продемонстрували, що тромбопоетин індукує фосфорилювання тирозину Vav у клітинах FDCP-hMpl5, які експресують c-Mpl людини, рецептор тромбопоетину. Однак ми продовжили ці дослідження, показавши, що Vav присутній у тромбоцитах і що він індуцирує фосфорилювання тирозину після лікування тромбопоетином. Ці дані свідчать про те, що Vav може відігравати роль у передачі сигналів тромбопоетином. Ми також виявили, що Vav може відігравати роль у подіях сигналізації після агрегації тромбоцитів, і на відміну від фосфорилювання Vav, індукованого різними іншими агентами, тромбопоетин індукує фосфорилювання тирозину Vav без активації протеїнкінази C.

      Одним з кандидатів на опосередкування фосфорилювання тирозину Vav є Jak-2, оскільки, як повідомляється, тромбопоетин, тромбін, іонофор кальцію або складний ефір індукують фосфорилювання Jak-2. 2,6-9,46 Однак ступінь фосфорилювання Jak-2, індукований тромбіном, був набагато слабкішим, ніж індукований тромбопоетином, тоді як обидва реагенти викликали подібний ступінь фосфорилювання Vav (рис. 1 та дані не показані). Таким чином, активація Jak-2 не може легко пояснити фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах, стимульованих тромбіном.

      Раніше постулювали роль тирозинкінази p72syk у фосфорилюванні тирозину Vav у макрофагах. 56 Відомо, що тромбін, міметики тромбоксану та колаген індукують фосфорилювання тирозину та активацію p72syk, навіть коли агрегація тромбоцитів пригнічується пептидом RGDS.62-65 Таким чином, можливо, що p72syk бере участь у фосфорилюванні тирозину Vav, індукованому цими агоністами . З іншого боку, ми виявили, що p72syk не був суттєво фосфорильований тирозином у тромбоцитах, стимульованих тромбопоетином (дані не наведені). Ці дані в поєднанні з даними про активацію протеїнкінази С демонструють, що лікування тромбоцитами та тромбопоетином тромбоцитів призводить до диференціальної активації кількох сигнальних шляхів і найбільш відповідає стимуляції тромбіну та тромбопоетину, що має окремі шляхи для фосфорилювання тирозину Vav.

      Нарешті, Vav може відігравати роль у передачі сигналів після агрегації, про що свідчить перерозподіл Vav у цитоскелет після стимулювання тромбином агрегації тромбоцитів. Це схоже на те, що було описано для p60 c-src, p59 c-fyn, c-Cbl та α IIbβ3 інтегрину. 4,34,36,45 Аміноконцева частина Vav містить область, подібну до деяких актинозв'язуючих білків, таких як кальпонін та α-актинін, що може дозволити зв'язування Vav з ниткоподібним актином. 52,66 Оскільки видалення аміноконцевої частини Vav призводить до набуття онкогенного потенціалу Vav, 52 перерозподіл до цитоскелету може мати важливе значення для нормальних функцій Vav, на відміну від онкогенної функції Vav. Раніше було показано, що Vav асоціюється з Grb2 у клітинах кровотворення. 11,44 Однак фізіологічне значення асоціації невідомо. Оскільки Vav також конститутивно асоціюється з Grb2, адаптерним білком SH2/SH3, у тромбоцитах Vav та Grb2 можуть набирати більше сигнальних молекул у цитоскелет. Ця гіпотеза була прямо підкріплена нашими попередніми висновками про те, що Grb2 також перерозподіляється до цитоскелета тромбоцитів залежно від агрегації.4

      На закінчення, наші дані свідчать про те, що існує два шляхи, що ведуть до фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах. Один з них, спричинений тромбопоетином, схоже, не включає активацію фосфоліпази С і може бути опосередкованим Jak2. Інший шлях може йти за течією активації фосфоліпази С із помірним фосфорилюванням Jak-2. Останній шлях може включати p72syk. Наші дані також свідчать про те, що Vav може відігравати роль у подіях агрегації, оскільки ми виявили, що Vav перерозподіляється в цитоскелеті під час агрегації тромбоцитів і є ендогенним субстратом кальпаїну.

      ПОДЯКІ

      Ми вдячні докторам Джунічі Камбаясі, Томасу Дж. Куніцькому, Amgen, Inc та Green Cross Co за люб'язну допомогу. Ми також дякуємо доктору Акіхіко Шімосаці за його постійне заохочення та корисні коментарі.

      Ю.М. та А.О. внесли однаковий внесок у це дослідження і повинні розглядатися як перші автори.

      Частково за підтримки Грантів на допомогу Міністерства освіти, науки та технологій Японії (YI та AO), Фонду медичних досліджень Ryoichi Naito (AO) та Наукових грантів на науку про життя та медицину, Фонд медичних наук університету Кейо ( AO).

      Надішліть запити на передрук Ацусі Оді, доктору медицини, кафедрі внутрішньої медицини, Медичній школі університету Кейо, 35 Шинаномачі, Сінджуку-ку, Токіо 160, Японія.