Структурне дослідження мутаційно-викликаної інактивації мускаринового рецептора людини М4

Цзинцзин Ван

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

рецептора

b Школа життєвих наук та технологій, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

c Центр досконалості CAS у галузі молекулярних клітинних наук, Шанхайський інститут біохімії та клітинної біології, Китайська академія наук, Шанхай, Китайська Народна Республіка,

d Університет Китайської академії наук, Пекін 100049, Китайська Народна Республіка,

Мен Ву

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

b Школа життєвих наук та технологій, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Ліцзе Ву

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Юемін Сю

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Фей Лі

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Іран Ву

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Петро Попов

e Інститут науки і техніки "Сколково", Москва, Російська Федерація,

Лін Ван

f Шанхайський інститут попередніх імунохімічних досліджень, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Клык Бай

b Школа життєвих наук та технологій, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

f Шанхайський інститут попередніх імунохімічних досліджень, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Сувен Чжао

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

b Школа життєвих наук та технологій, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Чжи-Цзе Лю

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

b Школа життєвих наук та технологій, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Тянь Хуа

Інститут iHuman, Шанхайський університет, Шанхай, 201210, Китайська Народна Республіка,

Пов’язані дані

Посилання на PDB: мускариновий рецептор M4, 6kp6

Анотація

1. Вступ

Мускаринові ацетилхолінові рецептори (mAchRs) - це цілісні мембранні білки, які належать до рецепторів, пов'язаних з G-білками класу A (GPCR), і активуються нейромедіатором ацетилхоліном (Ach; ​​Fredriksson et al., 2003). Серед п’яти підтипів мускаринових рецепторів підтипи M1, M3 та M5 поєднуються з білком G Gq/11, активуючи фосфоліпазу C та збільшуючи цитозольний Ca 2+, тоді як підтипи M2 та M4 з’єднуються з Gi/o, опосередковуючи інгібування аденилила циклаза (Hulme et al., 1990 ▸). Кожен підтип mAchR також має унікальний розподіл у периферичній або центральній нервовій системі в організмі людини, і вони є привабливими мішенями для лікування різних патофізіологічних станів, включаючи хронічну обструктивну хворобу легень (ХОЗЛ), гіперактивний сечовий міхур та синдром Шегрена (Eglen, 2012 р.; Eglen та ін., 1996 р.).

Висока послідовність та структурна подібність серед підтипів mAchR роблять селективний дизайн ліганду досить складним, що виключає точну модуляцію mAchR для терапевтичних переваг. На периферії M4 експресується в різних передперехідних нервових закінченнях, діючи інгібуючи передачу парасимпатичної та симпатичної передач, тоді як в центральній нервовій системі (ЦНС) M4 розподіляється в смугастому тілі і локалізується з дофаміновими рецепторами на проекційних нейронах . М4 також відіграє важливу роль при різних захворюваннях рухових розладів, таких як хвороба Паркінсона та дистонія (Bernard et al., 1992 ▸; Eskow Jaunarajs et al., 2015 ▸; Ztaou et al., 2016 ▸). Більшість мускаринових антагоністів, таких як атропін і тіотропій, комерційний препарат, який в даний час використовується для лікування ХОЗЛ (Kato et al., 2006 ▸), є неселективними. Слабкий M4-селективний антагоніст тропікамід використовується для розширення зіниці для огляду та інших діагностичних процедур (Lam et al., 2010 ▸; Yazdani et al., 2018 ▸). Було вирішено кілька структур мускаринових рецепторів ацетилхоліну, як показано в таблиці 1 ▸. Більшість з них перебувають у неактивних станах з неселективними антагоністами або зворотними агоністами.

Таблиця 1

mAChRS Стан структуриPDB codeResolution (Å) LigandReference
М1Неактивний 5cxv 2.7 Тіотропій Тал та ін. (2016 рік)
Активний 6oij 3.3ІпероксоМаеда та ін. (2019 ▸)
М2 Неактивний 3uon 3.0QNB † Хага та ін. (2012 рік)
5zkc 2.3 НЧ ‡ Суно та ін. (2018 ▸)
5yc8 2.5 Нові країни-члени Суно та ін. (2018 ▸)
5zkb 2.95 AF-DX 384 Суно та ін. (2018 ▸)
5zk8 3.0 Нові країни-члени Суно та ін. (2018 ▸)
5zk3 2.6QNBСуно та ін. (2018 ▸)
Активний 4mqt 3.7Іпероксо, LY2119620 Крузе та ін. (2013 рік)
4mqs 3.5 Іпероксо Крузе та ін. (2013 рік)
6oik 3.6Іпероксо, LY2119620Маеда та ін. (2019 ▸)
М3 Неактивний 4daj 3.4 ТіотропійКрузе та ін. (2012 рік)
4u14 3,57ТіотропійКрузе та ін. (2012 рік)
4u15 2.8Тіотропій Крузе та ін. (2012 рік)
4u16 3.7Нові країни-члени Крузе та ін. (2012 рік)
5жп 3.16o (BS46) Лю та співавт. (2018 ▸)
М4Неактивний 5dsg 2.6ТіотропійТал та ін. (2016 рік)

Добре встановлено, що активація GPCR класу A ініціюється зв'язуванням лігандів, що індукує конформаційні зміни трансмембранних спіралей. Після активації однією з найбільш очевидних особливостей є те, що цитоплазматична сторона TM6 відхиляється від трансмембранного пучка. Кілька збережених або унікальних залишків беруть участь у процесі активації. По-перше, бічний ланцюг тумблера W 6.48 (індекси вказують нумерацію Баллестероса – Вайнштейна для GPCR; Ballesteros & Weinstein, 1995 ▸) в TM6 зазнає конформаційних змін, що розв’язує низку конформаційних рухів рецептора. Отже, залишок при 3,46 розриває контакт із залишком при 6,37 і утворює новий контакт з обертаним Y 7,53 в рамках дуже збереженого мотиву NPxxY TM7. Показано, що цитоплазматичні кінці TM3 і TM6 роз'єднуються через розрив сольового містка між R 3,50 в кінці TM3 (що є частиною збереженого мотиву СУХОГО) та E 6.30 в кінці TM6.

Кристалічні структури з високою роздільною здатністю виявили, що неактивні GPCR класу A можуть містити збережене місце зв'язування іонів Na + в центрі їх трансмембранного домену (Fenalti et al., 2014 ▸; Miller-Gallacher et al., 2014 ▸; Zhang et al., 2012 ▸). Іон Na + координується сольовим містком до D 2,50 разом із чотирма додатковими полярними взаємодіями з бічними ланцюгами рецепторів та молекулами води в кристалічних структурах високої роздільної здатності. Наприклад, іон Na + в рецепторі аденозину A2A людини (A2AAR) координується двома висококонсервативними залишками, D 2,50 і S 3,39, та трьома молекулами води (Liu et al., 2012 ▸). Встановлено, що іони Na ​​+ вибірково знижують спорідненість агоністів, але не антагоністів, що узгоджується зі структурною стабілізацією неактивного стану іонами (Suno et al., 2018 ▸). Однак ця іон-зв'язуюча кишеня Na + руйнується в активних рецепторах. Мутації навколо ділянки зв'язування іонів Na + мають великий вплив на рецепторну функцію у більшості GPCR класу A, або повністю скасовуючи зв'язування G-білка, або приводячи до конститутивного сигналу, незалежного від лігандів, або упередженого шляху (Suno et al., 2018 ▸; Fenalti et al., 2014 ▸; Huang et al., 2015 ▸).

Для того, щоб ідентифікувати нові селективні антагоністи для M4, ми вирішили застосувати інший підхід, створивши неактивний M4, індукований раціонально спроектованою мутацією N449 7.49 R, який бере участь у потенційному Na + -зв'язуючому кишені в трансмембранних доменах, для стабілізації білка. Маючи ще п’ять мутацій, які допомагають експресії та виходу білка М4, ми далі визначали кристалічну структуру інактивованого рецептора М4. Завдяки порівняльному аналізу нашої кристалічної структури та зв’язаного з тіотропієм M4 (запис PDB 5dsg; Thal et al., 2016 ▸) та функціональних аналізів, показано, що мутована структура M4 знаходиться в неактивному стані. Віртуальний скринінг сфокусованої бібліотеки лігандів з використанням нашої структури показав, що антагоністи є набагато кращими, ніж агоністи, і що мутація N449 7.49 R є ключовим елементом у запобіганні активації M4. Більше того, інактивована мутація була настільки ефективною, що спільно очищаючий, щільно зв’язаний ліганд потрапив у ортостеричну ділянку.

2. Експериментальні процедури

2.1. Конструювання, експресія та очищення білка

Дикий тип M4 містить довгу, ймовірно погано впорядковану третю внутрішньоклітинну петлю (ICL3), яка є складною для кристалізації. Для полегшення цієї проблеми було створено конструкцію злитого білка M4-PGS (Pyrococcus abyssi glycogen sintase; PDB entry 2bfw; Horcajada et al., 2006 ▸) з використанням накладеної ПЛР із шістьма мутаціями: I93 2.65 T, G150 4,43 A, I187 ECL2 A, S219 5,62 Y, N449 7,49 R та T459 8,49 E. Конструкцію клонували у модифікований вектор pFastBac1, що містив N-кінцевий тег FLAG епітопу, за яким слідував тег 10 × His. Конструкція включала ділянку розщеплення HRV 3C між S21 і S22 в N-кінці. Залишки 228–389 ICL3 замінено на PGS. Модифікований білок M4-PGS експресувався в клітинах комах Spodoptera frugiperda (Sf9) Super 3 за допомогою експресійної системи Bac-to-Bac Baculovirus (Invitrogen). Клітини Sf9 Super 3 інфікували при щільності клітин 2–2,5 × 10 6 клітин на мілітр високим титром вірусного запасу при кратності зараження (MOI) 5,0. Клітини збирали центрифугуванням протягом 48 год після зараження і зберігали при -80 ° C для подальшого використання.

2.2. Кристалізація в ліпідній кубічній фазі

Кристалізацію проводили за допомогою методу ліпідної кубічної фази (LCP) (Caffrey & Cherezov, 2009.). Концентрований M4-PGS змішували з моноолеїном з 10% (мас./Мас.) Холестерину (Sigma) у співвідношенні 2: 3 (мас.: Мас.), Використовуючи метод відновлення шприца. Суміш LCP розподіляли по 35 нл краплями на скляні пластини і покривали розчином осаджувача 800 нл, використовуючи робота NT8 (Formulatrix). Експерименти з кристалізації проводили на 96-лункових скляних сендвіч-пластинах (молекулярні розміри), які згодом зберігали в камері з зображеннями (Formulatrix) при 20 ° C. Кристали M4-PGS отримували в осаджувальних умовах, що складалися з 300 мМ діамонію гідрофосфату, 22–26% ПЕГ 300, 0,1 М HEPES натрію рН 7,8 і досягали повного розміру 20–30 мкм за 4–5 днів, як показано в Додаткова Рис. S1.

2.3. Збір даних та визначення структури

Дані рентгенівської дифракції збирали на променевій лінії 41XU на SPring-8, використовуючи детектор EIGER X 16M (довжина хвилі рентгенівського випромінювання 1 000 Å). Дифракційні зображення обробляли за допомогою XDS (Kabsch, 2010 р.) Та масштабували за допомогою службових програм із набору CCP4 (Winn et al., 2011 р.). Структура була вирішена шляхом молекулярної заміни Фазером (McCoy et al., 2007 ▸) з використанням структури M4 – тіотропію (запис PDB 5dsg; Thal et al., 2016 ▸) та структури домену PGS (запис PDB 2bfw; Horcajada та ін., 2006 р.) як окремі моделі злитих білків M4 та PGS. Доопрацювання, перебудова та визначення структури проводились за допомогою Phenix (Liebschner et al., 2019 ▸), BUSTER (Smart et al., 2012 ▸) та Coot (Emsley et al., 2010 ▸). Структура була завершена роботою R та значеннями вільних R 0,231 та 0,264 відповідно. Статистика уточнення узагальнена в таблиці 2 ▸ .

Таблиця 2

Значення в дужках вказані для оболонки з найвищою роздільною здатністю.