Спектроскопічна сигнатура патологічних процесів каріозного дентину на основі досліджень FTIR біологічних рідин у роті

Павло Середін

1 Кафедра фізики твердого тіла та наноструктур Воронезького державного університету, м. Воронеж, пл. 1, 394018, Росія

2 Уральський федеральний університет, вулиця Миру, 19, Катеринбург, 620002, Росія

Дмитро Голощапов

Юрій Іпполітов

3 кафедра дитячої стоматології з православ'ям, Воронезький державний медичний університет, м. Воронеж, вул. Студентська 11, 394006, Росія

Jitraporn Vongsvivut

4 Австралійський синхротрон (Synchrotron Light Source Australia Pty LTD), 800 Blackburn Rd, Клейтон, VIC 3168, Австралія

Анотація

Метою нашої роботи є пошук спектроскопічної сигнатури патологічних процесів каріозного дентину на основі досліджень молекулярного складу ротових біологічних рідин із застосуванням синхротронних методів FTIR. Цей комплексний аналіз отриманих даних показує, що ряд підписів присутній лише у спектрах дентину та ясенних рідин у пацієнтів, у яких розвивається карієс глибоких тканин дентину. Виявлені особливості та комплексний аналіз кількісних та якісних даних, що свідчать про розвиток патологій ротової порожнини, можуть підвищити якість стоматологічного скринінгу.

1. Вступ

Підвищення якості життя є пріоритетною тенденцією розвитку країни для будь-якої розвиненої країни. У рамках цієї тенденції вивчення розвитку захворювань порожнини рота, спричинених каріогенними процесами, має велике значення завдяки безпосередньому впливу карієсу на здоров’я та професійну діяльність людини [1,2].

Залишається проблемою ефективної персоніфікованої діагностики захворювань тканин глибокого дентину, яка є значною і невирішеною, оскільки запальні процеси в дентині можуть призвести не тільки до втрати частини зуба або навіть цілого зуба, а й до більшої кількості серйозні проблеми, що загрожують здоров’ю людини в цілому [3–5].

Природна реакція дентину на каріозний напад, особливо на ранніх стадіях розвитку патології, є основним предметом деяких найсучасніших досліджень [3,5,6]. В даний час ці зміни можна контролювати, головним чином, за допомогою набору методів швидкого аналізу, заснованих на аналізі слини [7–9] та язично-ключичній рідині [10,11], або запальних факторах згідно з аналізом сироватки [12–14]. Однак ці біологічні рідини не контактують безпосередньо з дентином, і зміни в їх складі можуть відбуватися внаслідок системних захворювань людини, інфекцій та травм та результатів різних подразників [15–18].

Ідеальним кандидатом на роль нового скринінгового об'єкта може бути дентинова рідина, яка відіграє важливу роль у розвитку карієсу дентину [19]. Дентинова рідина є похідним плазми крові, що містить білки сироватки, імуноглобуліни та розчинені мінеральні речовини [20]. Дентинова рідина переміщується з пульпи зуба, заповнює розгалужені проліферуючі дентинові канали, циркулює всередині них і активно взаємодіє з тканиною дентину. Бактеріальне проникнення в зубні канали відбувається внаслідок порушення цілісності зубної емалі та цементу [21,22]. У цьому випадку бактеріальні метаболіти дифундують через зубні канальці і викликають розвиток патологічних процесів у глибоких тканинах зубів [19]. Таким чином, дуже ймовірно, що рідина дентину та маркери патологічних процесів у твердих зубних тканинах, що містяться в ній, можуть потрапляти в ясенну борозни через дентинові канальці і, таким чином, змішуватися з рідиною із борозни, яка є сироватковим транссудатом [19]. Попередні дослідження показали, що в дентиновій рідині можна виявити характерний набір білків та інших молекул, що свідчить про розвиток патології, інфекції або прогресування запального процесу в тканинах [4,20,23].

На жаль, використання дентинової рідини для діагностики розвитку патології в глибоких тканинах зубів у людини дуже складне. Основна складність такого діагностичного підходу - складний алгоритм, що включає екстракцію дентинової рідини, особливо у випадку карієсу тріщин, коли необхідно визначити, чи виникають запальні процеси в дентині. Недоцільні та неетичні характеристики цієї процедури очевидні при розгляді початку каріозного процесу та відсутності фактів, що підтверджують запалення в дентині зуба.

Екстракція ясенно-ключичної рідини для діагностики патології дентину набагато простіша, і її молекулярний аналіз з підбором маркерів, що вказують на розвиток каріозних/патологічних процесів дентину, можна виконати за допомогою методів молекулярної ідентифікації [10,11,24]. Тому представляється розумним застосовувати інфрачервону (ІЧ) спектроскопію як потужну техніку експрес-аналізу та інформативний, точний інструмент для вивчення молекулярного та фазового складу біологічних об’єктів [22]. Виділення прогностичних та валідаційних маркерів для розвитку патологічних процесів є окремою сферою інтересів серед проблем, що вирішуються за допомогою ІЧ-перетворення Фур'є (FTIR). ІЧ-спектроскопія може бути використана для визначення рівня пародонтиту [11,25] та схильності до розвитку карієсу, а також для моніторингу його розвитку [7]. На основі даних ІЧ-мікроспектроскопії представляється можливим вивчити зміни молекулярного складу біологічних рідин у ротовій порожнині при розвитку патології.

Література не містить жодної інформації про порівняння молекулярного складу дентину та ясенних рідин під час патологічних змін дентину для виявлення спектроскопічних ознак, тобто маркерів патології.

Тому ми шукали спектроскопічну сигнатуру патологічних процесів каріозного дентину на основі досліджень FTIR крові, дентину та ясенних рідин, а також визначили їх діагностичний потенціал для профілактичного скринінгу патологій ротової порожнини.

2. Матеріали та методи дослідження

2.1 Дизайн експерименту

У дослідженні взяли участь десять учасників (5 чоловіків та 5 жінок) у віці 22–28 років. Усі учасники були здорові та не приймали антибіотики, ліки, не палили та не вживали алкогольних напоїв. Усі учасники не мали жодних записів у своїх медичних картках за 1 рік до початку експерименту. Під час огляду кожен учасник мав зуби з вогнищами ураження, пов’язаними з первинним та вторинним карієсом, на стадії, що відповідає кодам 1 та 2 згідно з Міжнародною системою виявлення та оцінки карієсу (ICDAS). Учасники голодували протягом 12 годин і не пили рідини принаймні протягом 2 годин перед забором їх біологічних рідин. Після попереднього очищення ротової порожнини біологічну рідину відбирали о 10–12 ранку, щоб мінімізувати вплив циркадного ритму. Кожному учаснику було відібрано три зразки біологічної рідини: дентинова рідина, ясенна борозна та рідина.

2.2 Техніка відбору проб

Беручи до уваги досвід ряду досліджень, де капілярний ефект використовувався для отримання мікрооб’ємов рідини із ясенної борозни, ми підготували спеціальні поради для наших досліджень. Ми відбирали біологічні рідини, використовуючи ці наконечники (рис. 1 (а) –1 (в)).

Мікрокапіляри для відбору проб біологічних рідин. (а) Капіляр з ділянками, заповненими (1) чистим KBr, (2) нетканим фільтром та (3) адаптуючою трубою для мікробюрета. (b) Приклад відбору проби рідини з ясенної борозни. (c) Експериментальна установка для вивчення отриманих зразків біологічної рідини (HYPERION 3000).

Нанесений наконечник являє собою мікрокапіляри із зовнішнім діаметром 800 мкм і наповнений гомогенізованим порошком броміду калію (KBr), який був ущільнений за допомогою нетканого фільтра (рис. 1 (а)). KBr використовувався як інертний носій досліджуваної рідини, тоді як його вибір в якості наповнювача базувався на відсутності смуг поглинання в широкому діапазоні ІЧ-спектру.

Мікрокапілярій прикріплювали до стерилізованого шприца. Різниця в тиску в мікрокапілярі виникала або за допомогою поршневого інструменту прикріпленого шприца, або в результаті використання евакуаційної установки. Коли було досягнуто необхідне значення різниці тисків, тоді біологічна рідина потрапила в KBr.

2.3 Підготовка зразків

2.3.1 Дентинова рідина

Як зазначено вище, під час обстеження у кожного учасника були зуби, підозрілі на карієс поверхні емалі. Явних ознак розвитку пародонтозу або гінгівіту не спостерігалося.

Розвиток каріозного процесу в зубах був виявлений на основі нашого раніше розробленого підходу, коли мікрозони твердих зубних тканин продемонстрували більш високий вихід флуоресценції, ніж ділянки інтактної емалі через початкову дезорієнтацію кристалів апатиту [26].

Учасники з карієсом, виявленим після кофердамового відділення зуба, проходили підготовку як емалі, так і дентину за допомогою мікромоторного повітряного наконечника сферичної легованої зубної свердла з вольфрамовонадієвої сталі, що обертається зі швидкістю 4000 об/хв.

Після створення тріщини на жувальній поверхні зуба аж до отвору дентину спостерігали інфікований немінералізований шар жовтуватого дентину. Згодом, якщо обстеження підтвердило розвиток карієсу дентину, з підготовленої порожнини за допомогою мікрокапілярного наконечника та евакуаційної установки ALP-02 відбирали дентинову рідину. Тут герметичне ущільнення було зроблено на жувальній поверхні заготовленого зуба за допомогою гумової залози, і ця конструкція була прикріплена до евакуаційної установки. Це дозволило генерувати під гумовим сальником від'ємний тиск близько 0,9 атм/см 2, і таким чином зразок дентинової рідини можна було отримати не більше ніж за 1 хвилину.

2.3.2 Рідина ясенної борозни

Десневу рідину відбирали у кожного учасника з ясенної борозни того самого зуба, з якої брали проби дентинової рідини. Тут учасник спочатку ретельно промив ротову порожнину попередньо. Далі, щоб ізолювати область забору, зуби окантовували від вестибулярного та ротового ділянок стерильними ватними паличками. Зона відбору проб сушилася повітрям з безмасляного компресора. Потім ясенну борозна рідини відбирали за допомогою мікрокапіляра, як показано на рис. 1 (b) .

2.3.3 Кров

Кров відбирали у кожного учасника з тієї ж ясенної борозни після забору ясенної рідини. Десневу борозну інтубували за допомогою стерильного зонда і відбирали краплю крові за допомогою мікрокапіляра.

2.4 Налаштування обладнання та сканування зразків

Після відбору зразків порошок KBr з мікрокапілярів, що містять біологічні рідини, сушили при кімнатній температурі, а потім досліджували за допомогою ІЧ-мікроспектроскопії (IRM).

Молекулярний склад дентинової рідини, ясенної рідини та крові досліджували за допомогою ІЧ-спектроскопії та обладнання IRM-променів (Synchrotron, Вікторія, Австралія) за допомогою спектрометра Bruker VERTEX 80v у поєднанні з мікроскопом Hyperion 3000 FTIR (рис. 1 (c)) і рідким азотом охолоджуваним вузькосмуговим детектором телуриду кадмію ртуті (MCT) (Bruker Optik GmbH, Еттлінген, Німеччина) [27]. Усі спектри FTIR синхротронів реєстрували в спектральному діапазоні 3800‒700 см -1 при спектральній роздільній здатності 4 см -1. 3-кратна аподізація Блекмана-Гарріса, корекція фази Мерца та коефіцієнт нульового заповнення 2 були встановлені як параметри отримання за замовчуванням за допомогою набору програм OPUS 7.2 (Bruker Optik GmbH).

Для вимірювання синхротронної передачі FTIR невеликі шматочки порошкоподібного зразка переносили і пресовували між парою вікон мікроекспресійних комірок з алмазом (Thermo Fisher Scientific, Вікторія, Австралія), а також невеликий шматочок порошку KBr, що використовувався як ІЧ-фонове джерело [ 27]. Спектральні дані були отримані в режимі пропускання за допомогою 36-кратного об'єктива (числова апертура (NA) = 0,50; Bruker Optik GmbH), розмір фокуса променя діаметром 6,9 мкм і вісім спільно доданих сканів на спектр. Фонові спектри були отримані на KBr, який добре відокремлювався від порошкоподібного зразка всередині тієї ж алмазної компресійної комірки, використовуючи 32 сканування, додані одночасно.

Згідно з FTIR, на досліджувану систему слабко впливає зовнішній вплив; отже, інформацію про молекулярний склад зразка можна отримати без змін у результаті опромінення [7,12,14,27].

2.5 Спектральний аналіз

Спектральна обробка даних, побудова графіків, всі маніпуляції зі спектрами (видалення фону та корекція умов атмосфери), усереднення спектрів та інтеграція даних, а також всі розрахунки проводились за допомогою професійного набору програм OPUS (версія 7.2, Bruker Optik GmbH). Для згладжування спектральних даних застосовано фільтр-поліном Савіцкого-Голея другого порядку над п’ятьма точками даних.

3. Результати експерименту та обговорення

Експериментальні дані, отримані IRM, продемонстрували, що спектри однотипних зразків учасників включали абсолютно один і той же набір режимів вібрації. Крім того, ці спектри відрізнялись один від одного незначно лише змінами інтенсивності смуги коливань. Спектри зразків, усереднених за групами учасників, представлені на рис. 2, а всі інші обчислення проводились на основі аналізу усереднених спектрів. Процедура усереднення спектрів по експериментальній групі з часом дозволяє усунути випадкові помилки експерименту та індивідуальні особливості учасників певної групи [3].

Порівняння ІЧ-спектрів у діапазоні 2200–850 см -1 рідин ясен і дентину та крові, усереднених за групами учасників.

На малюнку 2 зображені ІЧ-спектри дентину та ясенних рідин та крові. ІЧ-спектри інтерпретувались на основі даних попередніх досліджень, що вивчали зразки біологічних рідин з ротової порожнини, а також білків та амінокислот, використовуючи FTIR [16,17,28–34].

Перша і найінтенсивніша група вібрацій, розташована на рівні 1725–1190 см −1, віднесена до білків. Серед цих груп можна розділити смуги вторинних амідів: амід I (коливання розтягування C = O в діапазоні 1725–1590 см -1), амід II (вигин N – H та розтяг C – N у 1590–1500 см −1 діапазону) та Аміду III (розтягнення C – N, вигин N – H у діапазоні 1350–1190 см -1), а також вібрації груп CH2/CH3, розташованих на 1480–1350 см −1 [25,34–36 ].

Наступна велика група вібраційних смуг, локалізована в межах 3600 см – 2800 см –1, пов’язана з наявністю молекулярних груп, пов’язаних з похідними білків у зразках (α-амілаза, альбумін, цистатини, муцини) та ліпідів та жиру кислоти [7,16,17].

Третя група коливань в ІЧ-спектрах, розташованих на рівні 1130–900 см -1, віднесена до молекулярних зв’язків, пов’язаних з фосфатами, гліцерофосфатами та фосфоліпідами [37,38], та з вуглеводами та похідними структур ДНК. Хоча ця група вібраційних смуг включає безліч вібрацій, пов'язаних з мінеральним компонентом (похідними фосфору) для зразків дентину та ясен, рідина крові включала режими низької інтенсивності, розташовані в цьому спектральному інтервалі. Ці режими відносять до молекулярних груп вуглеводів та похідних ДНК.

Поряд з описаними основними групами мод високої інтенсивності в спектрах зразків спостерігалося більше смуг, і їх інтенсивність була набагато нижчою, ніж у перших трьох групах. Однак їх поява в спектрах є ознакою протеоміки конкретної біологічної рідини та розвитку патологічного процесу в ротовій порожнині.

Особливу увагу слід звернути на ІЧ-спектри трьох біологічних рідин у таких спектральних інтервалах: 2200–1800 см -1, 1765–1725 см -1, 1171–1160 см -1, та вібрації в цих регіонах.

Перша група коливань у діапазоні 2200–1800 см -1 спостерігалась лише в спектрах дентину та ясенних рідин. Ці смуги можна віднести до тіоціанатів [7,31,32,39], які є показниками патологічних процесів у ротовій порожнині. Їх вміст підвищений при карієсі та захворюваннях пародонту [7]. Незважаючи на високоточну якість відбору зразків, ми також спостерігали вібрації низької інтенсивності вуглекислого газу (СО2), що поглинається в ясенних та дентинових рідинах та сироватці крові в цьому спектральному діапазоні. Однак інтенсивність коливань у діапазоні 2098–2065 см -1, що приписується тіоціанатам, що спостерігаються в спектрах дентину та ясенних рідин, була набагато вищою, ніж інтенсивність режиму СО2.

Для другої групи ІЧ-коливань в діапазоні 1765–1725 см -1 попередні дані [25,40] показують, що цю спектральну смугу можна віднести до вібрації комплексу> C = O і вона може бути пов’язана з карбоновою група складного ефіру (складний ефір карбонілу). Присутність складних ефірів у твердій зубній тканині людини, наприклад, при карієсі зуба, було продемонстровано раніше [25,40]. Автори цих робіт зазначили, що складні ефіри частіше присутні в каріозній тканині, ніж в інтактній тканині [41].

Третя смуга вібрацій, яка спостерігається в діапазоні 1171–1160 см -1 в ІЧ-спектрах, пов’язана з вуглеводами, а підвищення рівня їх у ротових рідинах свідчить про розвиток каріозного процесу, як ми вже демонстрували раніше [7]. Хоча вуглеводів у пробі крові не виявляли, їх рівень у дентині та ясенних рідинах був досить високим.

4. Аналіз та обговорення отриманих результатів

На основі даних FTIR та підходу, випробуваного в наших попередніх роботах [37,42], ми порівняли молекулярний склад дентину та ясенної рідини та крові. Раніше [37,42] ми показали, що математична оцінка молекулярного складу біологічних рідин людини може бути виконана на основі розрахунків та аналізу різних взаємозв'язків (коефіцієнтів) між органічними та мінеральними компонентами зразка рідини. Застосовуючи запропонований підхід, дуже зручно використовувати такі коефіцієнти.

Перший коефіцієнт, R1 (Амід II/Амід I), можна розрахувати із співвідношення інтегральної інтенсивності смуги Амід II (розтягнення CN, коливальні коливання NH) в діапазоні 1600–1458 см -1 до коефіцієнта аміду Діапазон I (розтягуючі вібрації C = O) в діапазоні 1720–1600 см -1.

Другий коефіцієнт, R2 (Тіоціанат/Білок), запропонований раніше [39], можна розрахувати із співвідношення інтегральної інтенсивності смуги вібрацій −N = C = S, розташованого на рівні 2100–2050 см −1 і віднесеного до тіоціанату, до амідних смуг (Амід I та Амід II) у діапазоні 1720–1485 см -1.

Взаємозв'язок R3 (ефір/амід I) визначається відношенням інтегральної інтенсивності карбонової групи складного ефіру (складний ефір карбонілу) в діапазоні 1740–1710 см -1 до інтенсивності смуги аміду I (C = O розтягування) в діапазоні 1720–1600 см -1.

Ці взаємозв'язки були розраховані за допомогою OPUS 7.2 (Bruker) і включали широкий набір функціональних можливостей для обробки та оцінки даних ІЧ-спектроскопії. На рисунку 3 представлені результати розрахунків коефіцієнтів R1 – R3.