Сегрегація області HLA/TNF пов’язана з клінічним спектром прокази в сім’ях, що демонструють змішані підтипи прокази.

Анотація

Щороку у світі діагностується приблизно 600 000 нових випадків прокази. Спектр захворювання широко варіює від обмежених туберкулоїдних форм до великих лепроматозних форм. Міра ризику розвитку лепроматозних форм прокази забезпечується ступенем реактивності шкіри на лепромін (реакція Міцуди). Для вирішення постульованого олігогенного контролю патогенезу прокази ми досліджували в цьому дослідженні зв'язок сприйнятливості проказу, клінічних підтипів прокази та ступеня реакції Міцуди на шість хромосомних областей, що мають відомі або підозрювані локуси сприйнятливості прокази. Єдиним значущим результатом було зв’язок клінічного підтипу прокази з областю HLA/TNF на хромосомі людини 6p21 (Pcorrected = 0,00126). Крім того, ми встановили, що в межах однієї родини різні гаплотипи HLA/TNF розділяються на пацієнтів з різними підтипами прокази, що безпосередньо демонструє важливість цього регіону геному для контролю клінічного представлення прокази.

Вступ

Проказа - це хронічне інфекційне захворювання, головним чином шкіри та нервів, спричинене повільно зростаючим внутрішньоклітинним збудником Mycobacterium leprae. 1 Хвороба в даний час вражає 1,4 мільйона людей, більшість пацієнтів виявляється в Індії та Бразилії. 2 У класичній класифікації Рідлі – Джоплінга 3 випадки туберкулоїду (ТТ) та лепроматозу (ЛЛ) займають протилежні кінці безперервного спектру проявів хвороби. Випадки ТТ свідчать про залучення кількох чітко виражених уражень шкіри з рідкісними паличками в шкірі та нервах та наявність сильних протизапальних-М. лепра опосередкований клітинами імунітет. Випадки ЛЛ демонструють значні ураження шкіри, наявність численних паличок у шкірі та нервах та анергію на М. лепра антиген. Клінічний тест для вимірювання якості антитіл-М. лепра імунна реакція - це так звана реакція "Міцуди" на внутрішньошкірне введення тепла М. лепра палички (лепромін). Позитивна відповідь свідчить про низький ризик розвитку лепроматозної прокази, тоді як не реагування на лепромін виявляється у осіб із підвищеним ризиком розвитку лепроматозної форми прокази 4 .

Метою нашого поточного дослідження було подальше розшифрування генетичної системи, яка бере участь у контролі патогенезу прокази. Зокрема, ми були зацікавлені у визначенні генів сприйнятливості, які діяли б паралельно NRAMP1 ген у в'єтнамській популяції, що безпосередньо демонструє олігогенний характер сприйнятливості до прокази. Ми вирішили проблему, протестувавши шість хромосомних областей, відомих або запропонованих для носіння локусів сприйнятливості до прокази, на зв'язок з трьома різними фенотипами прокази (тобто проказою) як такі, протип прокази та ступінь реактивності Міцуди) у групі з 20 сімейств мультиплексних проказ. Зокрема, ми перевірили можливий внесок у сприйнятливість до прокази в області хромосоми 10p13, запропонувавши нести ген сприйнятливості до прокази за допомогою недавнього сканування, 13 в області 17 хромосоми, що містить VDR ген, 14 ст HLA/TNF область на хромосомі 6, 18, а також рецептор фактора некрозу пухлини 1 і рецептор 2 (TNFR1 і TNFR2) області на хромосомі 12 та хромосомі 1 відповідно, а область кластеру цитокінів на хромосомі 5q.

Результати

20 ядерних сімей, включених у дослідження, включали 118 сибсів (59 з проказою та 59 здорових) з наявними фенотипами та молекулярними даними. Розподіл кількості сімей за клінічними підтипами уражених дітей наведено в таблиці 1. Переважна більшість пацієнтів, представлених як туберкульозні (ТТ: 35%) або лепроматозні (ЛЛ: 28%) випадки, що представляють два протилежні кінці в спектр клінічних підтипів прокази (рис. 1а). Ступінь реакції Міцуди була відома всім братам і сестрам і використовувалась для тестування на додаткові локуси, які могли брати участь у генетичному контролі чутливості на лепромін. Розподіл реакції Міцуди, кодованої як кількісний фенотип, показаний на малюнку 1b. Відповідний розподіл при використанні впорядкованого категоріального визначення чотирьох класів становив 22, 41, 38 та 17 для першого класу (⩾ 10 мм) відповідно.

Розподіл клінічних фенотипів серед нащадків 20 досліджених сімей. (а) розподіл підтипів прокази серед 59 нащадків, уражених проказою (TT = туберкулоїд, BT = прикордонний туберкулоїд, BB = пограничний, BL = прикордонний лепроматозний, LL = лепроматозний, I = невизначений). (b) Розподіл спостережуваних реакцій Міцуди серед 118 нащадків (59 випадків прокази; 59 здорових сибсів).

Приклад сегрегації HLA/TNF гаплотипи серед двох сімейств прокази. TNFp позначає TNF (-308) G/A промоторний поліморфізм; TNFa та TNFb - два маркери мікросупутника, розташовані неподалік від TNF ген. Позначення родин даються у верхньому лівому куті кожного родоводу, а статус хвороби (порожній, не уражений; ТТ, туберкулоїд; ЛЛ, лепроматозний; ВВ, межовий) вказується в кожному родоводі. Позначення алелів даються довільно присвоєними номерами алелів, що розділяються в сім'ях.

Обговорення

Для генетичного аналізу було обрано три фенотипи, що відображають різні аспекти патогенезу прокази: проказа як такі, тип прокази та ступінь реактивності шкіри Міцуди, яку також називають реактивністю лепроміну. Останній фенотип представляє інтерес, оскільки реактивність лепроміну пов’язана з ризиком розвитку LL-форми захворювання та наявністю реакцій зворотного розвитку I типу. 20 Реакції гіперчутливості, що повертаються до типу I, у свою чергу є основною причиною порушення функції нервової системи при проказі. 1 Зв'язок цих трьох фенотипів сприйнятливості з шістьма хромосомними областями тестували у 20 сімействах мультиплексних проказ. У цих же сім'ях ми раніше виявляли генетичний ефект NRAMP1 хромосомна область на хромосомній області 2q35 на сприйнятливість до прокази 9 та ступінь тесту Міцуди. 4

Жоден з регіонів-кандидатів не продемонстрував значних доказів зв’язку з імунною реакцією, виміряною за допомогою шкірного тесту на лепромін. Особливо несподіваною була відсутність зв'язку з Росією HLA/TNF регіону, оскільки поширена думка, що HLA алелі є основними генетичними елементами контролю антимікобактеріального імунітету. На відміну від цього, ми раніше виявляли сильний вплив NRAMP1 хромосомна область при тій же імунній відповіді. 4 Приклад генетичного контролю реактивності лепроміну чітко показує, що основні генетичні пускові механізми антимікобактеріальних імунних відповідей можуть бути розташовані поза HLA/TNF складний, як було запропоновано раніше іншими дослідженнями. 21

У цьому дослідженні виявлено невипадкову сегрегацію HLA/TNF гаплотипи у пацієнтів з різними формами прокази. Через тісний зв'язок TNF з HLA гени класу I та класу II неможливо зробити висновок про будь-який конкретний ген як причину спостережуваних спотворень сегрегації. Найвідомішим поліморфізмом, що впливає на біологічну активність ФНО, є TNF−308 G/A SNP. Отже, несуттєві зв'язки призводять до підтипів прокази, отриманих для TNF −308 промотор і TNFR поліморфізми аргументують головну роль Росії TNF алелі в патогенетичних процесах, які з часом призводять до різних клінічних проявів прокази. З цих міркувань ми робимо висновок, що упереджена сегрегація HLA/TNF регіон нащадків з різними клінічними формами прокази в одній родині в основному спричинений HLA гени регіону, крім TNF, ймовірно HLA варіанти гена класу II.

Предмети та методи

Сім'ї

Досліджені нуклеарні сім'ї відповідають вибірці, виявленій із записів Дерматологічної лікарні в місті Хошимін і раніше використовуваній для аналізу зв'язку з NRAMP1 ген. 4,9 Ця сімейна вибірка включає 20 нуклеарних сімей (118 дітей, 59 з проказою) з принаймні двома братами та сестрами, ураженими проказою. Співвідношення в'єтнамців (16 сімей) до китайців (чотири сім'ї) відображає приблизно частку обох етнічних груп у реєстрі. Схвалення дослідження отримано від органів охорони здоров’я міста Хошимін, В’єтнам та комісії з огляду інституцій Науково-дослідного інституту Центру здоров’я університету Макгілла (MUHC), Монреаль, Канада.

Визначення фенотипу

Діагноз прокази проводили щонайменше двома незалежними та досвідченими лепрологами після фізичного обстеження кожного пацієнта (зокрема, реєстрували кількість та зовнішній вигляд уражень шкіри, наявність або відсутність анестезії та оцінку периферичних нервів) та стандартне гістопатологічне дослідження уражені ураження шкіри. Оскільки когорта пацієнтів містила багатобацилярні випадки, мікробіологічне підтвердження клінічного та гістопатологічного діагнозу за допомогою кислотостійких бацил було можливим приблизно у половини пацієнтів. Клінічний підтип визначали за п'ятигруповою системою Рідлі та Джоплінга. 3

Всі реакції Міцуди проводились досвідченими в’єтнамськими лепрологами та були прочитані через 28–30 днів після внутрішньошкірного введення 0,1 мл лепроміну у волярну поверхню передпліччя. Реакцію Міцуди вимірювали у 118 дітей (включаючи здорових осіб), які належали до 20 нуклеарних сімей із розмірами сибсів від 2 до 12. Однак через обчислювальні обмеження максимальна кількість сибсів на сім'ю була обмежена дев'ятьма. Отже, для двох сімей з 10 та 12 сибами ми видалили найменшого та трьох наймолодших не уражених сибсів відповідно. Для подальших аналізів спочатку реакція відстроченого лепроміну розглядалася як кількісна ознака, яка коливається від 0 до 14 мм. Ми також закодували реакцію Міцуди як категоричну ознаку чотирьох класів: ⩾ 10 мм. Точки різання 3 і 5 мм визначаються відповідно до рекомендацій Шостого міжнародного конгресу прокази, що відбувся в Мадриді (1953), і останнього (тобто 10 мм), як пізніше запропонував Лангільйон. 30 Реакція Міцуди ⩾ 10 мм є явно позитивною.

Генотипування

З 16 маркерів, використаних у дослідженні, 13 були маркерами мікросателітного повтору, а три - однонуклеотидними поліморфізмами (SNP).

СНП: Два SNP, розташовані в нуклеотидному положенні 1056 на 3 'кінці та нуклеотидному положенні 117 в екзоні 2 VDR ген (номер приєднання XM_007046; маркери VDR-1056 та VDR-117 відповідно) оцінювали за допомогою ПЛР-RFLP. Область VDR-1056 C/T SNP ампліфікували за допомогою праймерів, описаних Roy et al. 14 Отриманий продукт ампліфікації перетравлюють 1,5 одиницями TaqРестрикційний фермент протягом 6 год при 65 ° C, а алельний склад у локусі VDR-1056 отримували шляхом проклеювання фрагментів на 2,5% агарозному гелі. SNP VDR-117 T/C генотипували, використовуючи праймери та умови, як описано Скоттом та ін. 33 Нарешті, TNF-(−308) G/A SNP генотипували за допомогою 5 ′ аналізу нуклеази 34,35 з використанням прямого праймера, 5 ′ IndexTerm CCAAAAGAAATGGAGGCAAT3 ′, зворотного праймера, 5 ′ IndexTerm GCCACTGACTGATTTGTGTGT3 ′ та FAM-CCTCCTTC -TAMRA3 'та 5' IndexTerm TET-CCG TCCTCATGCCCCTCAAA-TAMRA3 'як алелеспецифічні олігонуклеотиди. Виклик генотипів базувався на співвідношенні FAM/TET, яке було прочитано у флуоресцентному спектрометрі Perkin-Elmer LS-5B з шириною щілини 5 нм.

Статистичні методи

Аналіз зв'язків проводився з використанням підходу MLB, який може обробляти двійкові (тобто постраждалі проти не постраждали), категоріальні (підтипи прокази та категоріальні Міцуди) та кількісні (кількісні Міцуди) фенотипи. 4. На додаток до можливості аналізу декількох типів фенотипу, цей метод надає три цікаві властивості, про які тут вимагали: (i) це метод аналізу зв'язку без генетичної моделі, тобто нам не потрібно вказувати основну генетичну модель, яка, у контексті прокази залишається невідомим; (ii) йому не потрібно розкладати рідні брати на свої складові пари сиб, що, як відомо, підвищує частоту помилок типу I (наприклад, див. Holmans 36), і 18 з наших 20 сімей містять більше двох сибсів; (iii) в контексті кількісних фенотипів, MLB не чутливий до фенотипового розподілу (зокрема, він не передбачає багатовимірної нормальності), як показали великі імітаційні дослідження 37 .

Проаналізувати бінарну проказу як такі фенотип (уражений/не зазнав впливу), ми використовували підхід MLB для бінарних ознак. 38,39 Тест на зв'язок MLB - це тест коефіцієнта ймовірності, який може бути виражений як одностороння стандартна нормальна статистика, що позначається як ZMLB.

Аналіз кількісних та категоріальних ознак проводили з використанням відповідних розширень методу MLB. 40,41 Ці розширення засновані на введенні індивідуальної прихованої двійкової змінної, яка фіксує інформацію про зв'язок між спостережуваною кількісною ознакою та маркером. У контексті фенотипів Міцуди (кодованих як кількісні або категоричні), значення 0 (відповідно 1) для цієї двійкової змінної можна розуміти як „абсолютний” негативний (відповідно позитивний) результат Міцуди. Метод повинен вказати ймовірність значення прихованої змінної (тобто мати негативну або позитивну реакцію) відповідно до спостережуваного фенотипу. Для аналізу кількісного Міцуди ми використовували стандартний кумулятивний нормальний розподіл, запропонований Алкайсом та Абелем. 40 Для аналізу категоричної Міцуди ми зафіксували ймовірність мати значення 0 на рівні 1, 0,75, 0,25 та 0 для фенотипів, що належать до першого (⩾ 10 мм) класу відповідно, як уже було запропоновано в попередньому дослідженні. 4

Для підтипу прокази ми використовували той самий підхід, що і для категоричного фенотипу Міцуди. У цьому випадку значення 0 можна розуміти як „абсолютний” туберкулоїдний випадок, а симетрично значення 1 відповідає „абсолютному” лепроматозному випадку. Ми встановили ймовірність мати значення 0 на рівні 1, 0,75, 0,5, 0,5, 0,25 та 0 для ТТ, прикордонного туберкулоїду (БТ), прикордонного прикордонного (ВВ), невизначеного (І), прикордонного лепроматозного (БЛ) та ЛЛ відповідно ( тому для осіб BB або I ймовірність бути TT дорівнює ймовірності LL, тобто 0,5). Знову ж таки, тест на зв'язок - це тест коефіцієнта ймовірності, виражений як одностороннє стандартне нормальне відхилення, позначене ZMLBQ та ZMLBC для кількісних та категоріальних фенотипів відповідно.

Багатоточковий аналіз зв'язків проводився з використанням розширення попередніх методів, яке було реалізовано в розширеній програмі 42 GENEHUNTER, доступній за запитом. Нарешті, щоб врахувати багаторазові порівняння, ми виправили спостережуване P-значення за допомогою корекції Бонферроні. Оскільки шість незалежних регіонів були досліджені (HLA/TNF область, область хромосоми 5q, TNFR області, хромосома 10р область і VDR область), виправлене значення p (позначене як pc) було в шість разів більше, ніж спостерігалося P-значення (наприклад спостережуване P-значення 0,01 відповідає a Pc 0,06).