Роман для прийому всередину протигрипозного проліки AV5075S

Олександр В. Івачченко, Ян А. Іваненков, Олег Д. Міткін, Павло М. Яманушкін, Вадим В. Бічко, Наталія А. Шевкун, Ольга Василівна Мокрушина, Ольга О. Неволіна, Рубен Н. Карапетян, Ірина А. Лєнева, Ірина Т. Федякіна, Марк С. Веселов, роман-кандидат на пероральний препарат проти грипу AV5075S, Журнал антимікробної хіміотерапії, том 69, випуск 5, травень 2014 року, сторінки 1311–1324, https://doi.org/10.1093/jac/ dkt507

Анотація

Розробка нового кандидата на ліки з покращеною активністю проти нейрамінідази вірусу грипу (NA) порівняно з наявними в даний час терапевтичними препаратами.

Синтезовані сполуки оцінювали in vitro та in vivo. Тривимірна молекулярна стиковка була успішно застосована для класифікації сполук у серії за інгібуючою потужністю. Стабільність досліджували у зразках крові та на моделях тварин. Фармакокінетичне дослідження проводили на собаках та щурах із застосуванням перорального та внутрішньовенного введення.

Новий високопотужний лікарський кандидат [(3R, 4R, 5S) -4- (2,2-дифторацетиламіно) -5-аміно-3- (1-етил-пропокси) -циклогекс-1-енкарбонова кислота; AV5027] та його етиловий ефір проліки (AV5075S) були синтезовані та випробувані. AV5027 та AV5075S проявляють пікомолярну активність щодо вірусу грипу NA. AV5075S інгібував NA на моделі пневмонії, використовуючи адаптований мишами вірус A/Aichi/2/68 (H3N2) значно сильніше, ніж осельтамівір фосфат. На основі експериментальних результатів та теоретичного аналізу був побудований загальний метаболічний шлях для вихідної сполуки.

AV5075S можна обґрунтовано вважати новим кандидатом на пероральний препарат для лікування грипу.

Вступ

Структури осельтамівіру, його аналогів, занамівіру, ланінамівіру та сполук, описаних у цій роботі (AV5027, AV5075, AV5095, AV5102 та AV5092).

Нещодавно ми оголосили про нову сполуку [(3R, 4R, 5S) -4- (2,2-дифторацетиламіно) -5-аміно-3- (1-етил-пропокси) -циклогекс-1-енкарбонова кислота; AV5027] з пікомолярною активністю проти грипу NA. 6 Крім того, було проведено детальне кількісне дослідження співвідношення структура-активність (QSAR) із використанням тривимірного молекулярного стикування та класичного регресійного аналізу. Тут ми описуємо ключові фармакокінетичні особливості та активність in vitro та in vivo (моделі тварин) аналогів AV5027 (AV5075, AV5095, AV5102 та AV5092) (рис. 1), мезилатів (AV5075S та AV5095S) та метаболітів. Ми виявили, що AV5095 утворюється у нейтральному розчині в плазмі людини, собак та щурів ацилюванням AV5075.

Матеріали і методи

Віруси

А/California/7/2009 (H1N1) отримано від ATCC (Манассас, штат Вірджинія, США). Пристосований до миші A/Aichi/2/68 (H3N2) отриманий з Інституту вірусології Івановського (Москва, Росія). Очищені кристали N1 від вірусів A/California/7/2009 (H1N1) були отримані від ATCC.

Тварини

Безпітогенні самки білих безпородних мишей (12–14 г) були отримані з розплідника «Андріївка» (Московська область, Росія). Мишей переносили на карантин протягом 24 годин до зараження. Без мишей CD1 без специфічних патогенів (вік 6 тижнів) та щурів Sprague-Dawley (250–350 г) були отримані з відділення лабораторного розведення тварин Інституту біоорганічної хімії Російської академії наук (Московська область, Росія). Опушені собаки бігль обох статей (10–12 кг) були отримані з Інституту розведення тварин Російського науково-дослідного центру біологічно активних речовин (Московська область, Росія). Щурів Спрег-Доулі поміщали на карантин протягом 10 днів до вивчення фармакокінетики. Тварин утримували в окремих приміщеннях з контрольованим мікрокліматом (температура 18–26 ° C, відносна вологість 30% ± 70%, 8–10 об’ємів повітря в приміщенні на годину та 12 год цикл день/ніч). Догляд та догляд відповідали Керівництву з догляду та використання лабораторних тварин. 7

Аналіз NA

Вплив сполук на активність NA вимірювали за протоколом ВООЗ. 8 В якості флуоресцентного субстрату використовували натрієву сіль 2- (4-метиламбелферил) -α- d -N-ацетилнейрамінової кислоти (MUNANA; Sigma, кат. № M8639), з кінцевою концентрацією 0,1 мМ. Розведений алантоєвий вірус, що містить 800–1200 одиниць флуоресценції MUNANA, змішували з досліджуваною сполукою (0,01–10 000 нМ) у 33 мМ 2- (N-морфоліно) етансульфонової кислоти (рН = 6,5), що містить 4 мМ CaCl2, та інкубували протягом 30 хв. при 37 ° C. Після додавання субстрату та інкубації при 37 ° С протягом 1 години реакцію зупиняли додаванням 0,14 М NaOH у 83% етанолі. Флуоресценцію вимірювали при довжині хвилі збудження 360 нм та довжині хвилі випромінювання 448 нм. Заготовки основи віднімали з показань зразків. Потім значення IC50 обчислювали шляхом побудови графіку відсотка інгібування активності NA проти концентрації інгібітора. Результати були представлені як середнє значення трьох експериментів.

Тривимірна молекулярна стиковка

Молекулярне стикування здійснювали за допомогою програмного забезпечення ICM-Pro (офіційний веб-сайт: www.molsoft.com) 9 та кристалографічних даних щодо білків, виділених від вірусів грипу, які були доступні в ПБР (офіційний веб-сайт: www.rcsb.org). 10 Для силіко-моделювання ми використовували кристалографічні дані, отримані для NA грипу H1N1 у комплексі з карбоксилатом осельтамівіру (код PDB: 3TI6). 11 Режим зв’язування карбоксилату осельтамівіру порівняно з режимом, що спостерігався для ланінамівіру 12 та занамівіру. 11

Хімія

Загальна та аналітична хімія, а також синтетичні протоколи представлені в Додаткових даних (доступні на JAC Online). Карбоксилат осельтамівіру та фосфат осельтамівіру готували, як описано раніше. Початково синтезували 6 [(3R, 4R, 5S) -5-аміно-4- (2,2-дифторацетиламіно) -3- (1-етил-пропокси) -циклогекс-1-енкарбонову кислоту] метилат етилового ефіру (AV5075S) від комерційно доступної (3R, 4R, 5S) -4-аміно-5-бутоксикарбоніламіноаміно-3- (1-етил-пропокси) -циклогекс-1-енкарбонової кислоти та відповідного етилового ефіру 13, 14 (див. схему S1, доступну як Додаткові дані в JAC Online). (3R, 4R, 5S) -4-аміно-5- (2,2-дифторацетамідо) -3- (1-етилпропокси) циклогекс-1-енкарбонова кислота (AV5102) та її етиловий ефір (AV5095) були синтезовані з (3R, 4R, 5S) -етил-4-аміно-5-азидо-3- (1-етилпропокси) циклогекс-1-енкарбоксилат. 15 AV5095S та AV5102 були підготовлені, як показано на схемі S2 (доступні як Додаткові дані на JAC Online).

Стабільність AV5075S, AV5095S та AV5027 in vitro у буферах та плазмі

Стабільність in vitro AV5075S, AV5095S та AV5027 оцінювали, як описано раніше. 16–18 Сполуки інкубували в універсальних буферах (1 мкМ) при рН = 2, 4 або 7,4 та у плазмі людини, собак та щурів у двох примірниках при 37 ° С при обережному струшуванні. Аликвоти (60 мкл) збирали у заздалегідь визначені часові моменти (0, 1, 4 та 24 год) з наступною екстракцією ацетонітрилом (180 мкл), що містить 50 нг/мл внутрішнього стандарту толбутаміду. Зразки інкубували при -20 ° C протягом 15 хв, а потім центрифугували при 2000 році g протягом 10 хв. Супернатанти аналізували за допомогою LC-MS/MS. Ацетонітрил, ДМСО, мурашина кислота та вода мали ВЕРХ (Panreac). Толбутамід та верапаміл були отримані від Sigma. Об’єднану плазму людини в цитраті натрію плазми щурячої плазми Sprague-Dawley та собачу плазму (змішана порода) в Na2 EDTA отримували від Innovative Research (Нові, Мічиган, США). Універсальний буфер був отриманий від pION-Inc. (США) і використовували при бажаному pH.

Фармакокінетика AV5075S, AV5095S та AV5092

LC-MS/MS аналіз зразків після стабільності та фармакокінетичних досліджень

Мас-спектрометр (QTRAP 5500; AB Sciex, США) в поєднанні з системою UPLC (1290 Infinity; Agilent Technologies, Inc., США) використовували з колоною YMC-Triart C18 (1,9 мкм/12 нм/50 × 2 мм) . Використовували градієнтне елюювання (швидкість потоку: 0,4 мл/хв) з рухомою фазою вода/ацетонітрил з 0,1% мурашиною кислотою. З'єднання іонізували в режимі позитивної іонізації електророзпиленням. Масові переходи були такими: для AV5075S та AV5095S, m/z 349,2 → 120,0; для AV5027, m/z 321,0 → 251,0; для AV5102, m/z 321,0 → 138,0; та для AV5092, m/z 243,2 → 138,0. Внутрішні стандартні нормовані площі під кривою (AUC) використовувались для обчислення залишку вихідного препарату на кожний момент часу в дослідженнях стабільності (відносно t = 0 хв у%). Концентрації визначали за стандартними калібрувальними кривими в діапазоні 1–4000 нг/мл. Фармакокінетичні дані аналізували з використанням програмного забезпечення WinNonlin (Phoenix Corp., США) з використанням некомпонентних моделей. Розраховані параметри включали максимальну концентрацію в плазмі (Cmax) та час (Tmax), площу під кривою плазмової концентрації від першої до останньої часової точки (AUC0 – t) та з лінійною екстраполяцією до нескінченності (AUC0 – ∞), константу швидкості елімінації (kel), період напіввиведення (t½), середній час перебування, кліренс (CL) та об’єм розподілу (V). Пероральну біодоступність розраховували на основі AUC0 – t.

Оцінка ефективності in vivo

Результати

Інгібування NA in vitro

Виходячи з вірогідності того, що представлені сполуки (AV5027, AV5102 та AV5092) будуть інгібувати NA, враховуючи, що сполука свинцю (осельтамівір) є добре обґрунтованим інгібітором NA, їх тестували за допомогою аналізу NA, описаного вище. Значення IC50 щодо вірусної НС A/California/7/2009 (H1N1) представлені в Таблиці 1 з осельтамівіром карбоксилатом та занамівіром як контролем. Ці результати чітко вказують на те, що всі сполуки інгібували NA від цього вірусу. Однак значення IC50 охоплювали відносно широкий діапазон. AV5102 (IC50 = 16,49 ± 9,59 нМ) та AV5092 (IC50 = 29,31 ± 8,3 нМ) були значно менш активними, ніж осельтамівір карбоксилат (IC50 = 2,14 ± 0,13 нМ) та занамівір (IC50 = 0,49 ± 0,11 нМ), зі значним перекриттям у SEM . Зверніть увагу, що AV5027 (IC50 = 0,18 ± 0,03 нМ) був ∼3 і в 12 разів потужнішим, ніж занамівір та осельтамівір карбоксилат, відповідно.

Ефективність інгібування досліджуваних сполук проти A/California/7/2009 (H1N1) грипу NA