Межі в неврології

Автономна нейронаука

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Нейропротезичні терапевтичні підходи до імунних, нервових та судинних захворювань: теоретичні, експериментальні та клінічні аспекти. Переглянути всі 6 статей

Редаговано

МІШЕЛЬ ПАПА

Університет Кампанії Луїджі Ванвітеллі, Італія

Переглянуто

Бруно Боназ

Центр лікарні Університету Гренобля, Франція

Міріам О. Рібейро

Пресвітеріанський університет імені Маккензі, Бразилія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

1 Ключова лабораторія досліджень акупунктури та медицини Міністерства освіти Нанкінського університету китайської медицини, Нанкін, Китай
2 Партнерська лікарня Нанкінського університету китайської медицини, Нанкін, Китай

Вступ

У цьому дослідженні ми підтвердили терапевтичний ефект ЕА у щурів із ожирінням, спричиненим дієтою з високим вмістом жиру, та дослідили потенційні нейроімунні механізми, що лежать в основі цього ефекту, дослідивши експресію SNS, iWAT, SAM, NE, β3 адренергічний рецептор, UCP1 та Slc6a2 у щурів із ожирінням, які отримували ЕА.

Матеріали і методи

Тварини

Експериментальними тваринами було 65 відлучених (3 тижні) самців щурів Sprague-Dawley (Model Animal Research Center, Nanjing Medical University, China), які були розділені на звичайну дієтичну групу (контрольну групу), групу HFD та HFD з ЕА. групи. Щурів утримували в контрольованих умовах навколишнього середовища (температура: 22 ° C, відносна вологість: 40–60% та 12/12 год цикл світло/темрява) і їм надавали вільний доступ до води та їжі. Групу HFD + EA та групу HFD годували дієтою, що містила 45 ккал% жиру (Research Diets, D12451), забезпечуючи 473 ккал/100 г, а нормальну групу годували звичайною дієтою щурячого чау із забезпеченням 352 какл/100 г. Після годування протягом 11 тижнів проводили втручання ЕА у групі HFD + ЕА. Тривалість втручання ЕА становила 4 тижні. Вагу тіла тварин вимірювали щотижня. Перед вбивством трьом щурам із групи HFD вводили антагоніст β-рецепторів пропранолол у iWAT. Усі експерименти проводились відповідно до Принципів догляду за лабораторними тваринами та Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого Національною науковою радою, Китай.

Стимуляція Е.А.

ST25 (Тяньшу) знаходиться в 5 мм поперечно від перетину між верхніми 2/3 і нижньою 1/3 (Yu et al., 2013), у лінії, що з’єднує мечоподібний відросток і верхню межу лобкового симфізу. Область ST25 широко використовується в клінічних випробуваннях (Chen et al., 2018). Голки були підключені до приладу ЕА Хана (LH402A; Beijing Huawei Technologies Co. Ltd). Струм стимуляції становив 2 мА; змінна частота, 2/15 Гц; час стимуляції, 20 хв. Процедуру проводили 6 разів на тиждень і тривала 4 тижні. В експерименті з електрофізіології стимуляція ЕА тривала 60 с.

Електрофізіологічні вимірювання

Щурів із групи нормальної дієти та групи HFD знеболювали ізофлураном (RWD Life Science, Китай) і робили паховий розріз. Потім нерви, присутні в iWAT, були відокремлені та з'єднані з платиновими електродами з подвійними пазурами. Швидкість випалу реєстрували за допомогою попереднього підсилювача (NL100; CED, Великобританія) та біоелектричного модуля Micro1401-3 (NL125NL126; CED, Великобританія), підключеного до системи збору та аналізу біосигналів (Microl 1401-3; CED, Великобританія). Для фільтрації сигналів було встановлено значення 10–1000 Гц; частота дискретизації становила 20000 Гц, а посилення - 1000 разів. Дані реєструвались протягом 180 с кожен раз за допомогою програмного забезпечення Spike2: до EA, 60 с; під час ЕА, 60 с; після Е.А., 60 с.

ІФА

Стандартний або зразковий розчин (100 мкл) додавали до 96-лункових мікропланшетів полістиролу та інкубували при 37 ° C протягом 90 хв. Потім в лунки додавали 10 мкл біотинільованих антитіл (Нанкінський інститут біоінженерії Нанкін, Нанкін) і інкубували при 37 ° С протягом 60 хв. Потім розчин у кожну лунку відсмоктували і кожну лунку промивали тричі 350 мкл 1 × промивного буфера. Далі до кожної лунки додавали 100 мкл субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) та інкубували протягом 10 хв. Для зупинки реакції додавали 100 мкл стоп-розчину і лунки зчитували при 450 нм.

Вестерн-блот-аналіз

Пахову білу жирову тканину збирали за допомогою екстракційного набору жирового білка (MinuteTM) для вилучення білка. 80 мкг жирової тканини гомогенізували 300 мкл екстракційного буфера. Після центрифугування при 2000 об/хв протягом 1 хв тканину переносили у фільтруючий картридж із збірною трубкою та інкубували при -20 ° C протягом 15-20 хв. Після інкубації його негайно центрифугували при 2000 об/хв протягом 1-2 хв з відкритою кришкою. У протоці містилися загальні білки з жирової тканини. Потім 20 мкг загального лізату тканини відокремлювали SDS-PAGE (10% гелю для розділення та 5% гелю для концентрації). Електрофорез містив 80 В протягом 0,5 год і 120 В протягом 1 год. Білкові смуги переносили на PVDF-мембрану за допомогою Trans-Blot (Bio-Rad) і додавали 5% BSA протягом 2 годин для блокування мембрани. Потім мембрана реагувала з первинними антитілами проти: UCP1 (1: 1000, Abcam), норадреналінового транспортера (1: 1000, Abcam), β-актину (1: 1000, Abcam), β3 адренергічного рецептора (1: 1000, Abcam) і тирозингідроксилази (1: 1000, Abcam) при температурі 4 ° C протягом ночі. Інкубацію з відповідними вторинними антитілами (розведеними до 1: 3000, Abcam) проводили при кімнатній температурі протягом 1 год.

Іммунофарбовальна цілісна гора

Процедура базувалася на протоколі Xin (Li et al., 2019). Зразки iWAT занурювали у фіксуючий розчин (1% PFA в 1 × PBS, рН 7,4) при 4 ° C на 24–48 год. Зразки розрізали на кубики розміром 2 мм і фіксували 1 × PBS-TX. Потім їх блокували блокуючим буфером Sea Block (Thermo Fisher Scientific, США) протягом 2 год і інкубували з первинними антитілами проти наступних білків при 4 ° C протягом ночі: TH (1: 200, Abcam), F4/80 (1: 200, Санта-Крус), і транспортер NE NE Slc6a2 (1: 200, Abcam). Потім їх інкубували з відповідними вторинними антитілами (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 та Alexa Fluor 647, відповідно; Abcam) у розведенні 1: 200 при RT протягом 2 годин. Для оптичного зазору використовували 90% гліцерин, і зразки витримували при температурі 4 ° C у темряві, поки вони не стали прозорими. Зображення були зроблені за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа.

RT-PCR

Загальну РНК екстрагували з 200 мг iWAT за допомогою Trizol (TaKaRa, Японія). Загальна РНК була зворотно транскрибована для отримання кДНК за допомогою термоциклера (Bio-Rad, США) за допомогою PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa, Японія) при 37 ° C протягом 15 хв і 98 ° C протягом 15 с. Реакційна суміш ПЛР (20 мкл) містила 4 мкл прямого праймера, 4 мкл зворотного праймера, 2 мкл кДНК і 10 мкл SYBR Green Mix (TaKaRa, Японія). Протокол ПЛР був таким: 40 циклів ампліфікації протягом 30 с при 95 ° C, 5 с при 95 ° C і 30 с при 60 ° C. Дані обробляли методом 2 –ΔΔCT. Праймери, використані в експерименті, наведені в таблиці 1.

Таблиця 1. Послідовності праймерів, що використовуються для ПЛР в режимі реального часу.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою Prism 6.0. Усі дані представлені як середнє значення ± SE. Групи порівнювали, використовуючи односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA), а потім - post hoc Студентські тести Ньюмана-Кельса. P 0,05). (C) Відносний рівень білка TH (у контрольній, HFD та HFD + EA-групах) (n = 3, P > 0,05). (D) Форма сигналу, що представляє спонтанний розряд в eWAT під час EA в контрольній та HFD групі. (E) Процентна зміна швидкості випалу eWAT під час EA у контрольній та HFD групі (n = 6, **P Ключові слова: ожиріння, електроакупунктура, пахова біла жирова тканина, симпатична нервова система, симпатичний асоційований макрофаг

Цитування: Lu M, He Y, Gong M, Li Q, Tang Q, Wang X, Wang Y, Yuan M, Yu Z і Xu B (2020) Роль нейроімунних перехресних розмов у протидії ожирінню ефекту електро -Акупунктура. Спереду. Невроски. 14: 151. doi: 10.3389/finins.2020.00151

Отримано: 21 листопада 2019 р .; Прийнято: 10 лютого 2020 р .;
Опубліковано: 28 лютого 2020 року.

Мікеле Папа, Університет Кампанії Луїджі Ванвітеллі, Італія

Міріам Олівейра Рібейро, Пресвітеріанський університет Маккензі, Бразилія
Бруно Боназ, Центр госпітальєрського університету Гренобля, Франція