Рівень адипоцитів CES1, CRYAB, ENO1 та GANAB модифікується in vitro за допомогою обмеження глюкози та пов’язаний із клітинним ремоделюванням під час відновлення ваги

Ці Цяо

кафедра біології людини Школи харчування та трансляційних досліджень метаболізму NUTRIM, Медичний центр Університету Маастрихта, Маастрихт, Нідерланди

Фрік Г. Боуман

Марлін А. ван Баак

Надя Дж. Т. Руманс

b Інститут регенеративної медицини, натхненний технологіями, MERLN, Медичний центр Університету Маастрихта, Маастрихт, Нідерланди

Роел Г. Вінк

Сьюзен Л. М. Коорт

c Відділ біоінформатики Школи харчування та трансляційних досліджень метаболізму NUTRIM, Медичний центр Університету Маастрихта, Маастрихт, Нідерланди

Йохан В. Ренес

Едвін С. М. Маріман

Пов’язані дані

АНОТАЦІЯ

Вступ

Надмірна вага та ожиріння є основними факторами ризику для різних ускладнень зі здоров’ям, таких як діабет II типу, серцево-судинні розлади, апное сну та деякі види раку [1–4]. Поширеність надмірної ваги та ожиріння зростає у всьому світі, і на сьогоднішній день жодна країна успішно не змінила свою епідемію [5–7]. Ліки від ожиріння - це схуднення за допомогою дієтичного втручання, збільшення фізичної активності, фармакологічного лікування чи хірургічного лікування [1,8–10]. Однак до 80% осіб, які втрачають вагу на дієті з низьким енергоспоживанням, зазвичай відновлюють вагу і часто повертаються до своєї початкової ваги або навіть перевищують її протягом одного-двох років [2,11–17]. Поширене явище відновлення ваги не тільки робить зниження маси тіла менш ефективним, але й, схоже, спричиняє збільшення ризику метаболічних ускладнень [18]. Таким чином, їзда на вазі є основною проблемою надмірної ваги та ожиріння [5,14,19]. Тому важливо отримати більше знань про умови та механізми відновлення ваги після схуднення, щоб зберегти знижену вагу та супутні покращення здоров’я.

Результати

Морфологічні зміни крапель жиру адипоцитів під час обмеження глюкози та повторного годування

Схематичний огляд проекту дослідження. Преадипоцити SGBS у момент часу T0 диференціювали протягом 14 днів. Потім зрілі адипоцити використовували для початку контрольної групи для нормального годування (4 дні) та дослідної групи для обмеження глюкози (4 дні) та повторного годування (4 дні). GR: обмеження глюкози, RF: повторне годування.

Запис зрілих адипоцитів SGBS під час експерименту. a: зрілі адипоцити в момент часу T14, b: адипоцити при T18, c: адипоцити при T18GR, d: адипоцити при T22RF. a, b, c, d відображаються при збільшенні 400 × системою мікроскопічних камер. GR: обмеження глюкози, RF: повторне годування.

Діаметр крапель жиру для різних експериментальних стадій, починаючи з Т14.

Протеомічний аналіз обмеження глюкози (T14 проти T18GR)

Обмеження глюкози та повторне годування

Для експериментів GR зрілі адипоцити (T14) культивували в DMEM/F12 (1: 1) без глюкози та фенолового червоного (Cell Culture Technologies), доповнені 20 нмоль/л людського інсуліну та 0,1 ммоль/л глюкози протягом 96 год (T18GR ). В якості контролю зрілі адипоцити (T14), що походять з тих самих попередніх адипоцитів, культивували 96 год у нормальному живильному середовищі: те саме середовище DMEM/F12, доповнене 20 нмоль/л людського інсуліну та 17,5 ммоль/л D-глюкози (T18) [ 49].

Для РЧ-експериментів після 96 год під GR, клітини культивували в середовищі DMEM/F12, доповненій 20 нмоль/л людського інсуліну та 17,5 ммоль/л D-глюкози протягом ще 96 год (T22RF). Починаючи з Т14, середовище делікатно оновлювалось кожен другий день.

Моніторинг розміру крапель жиру

Середній діаметр усіх вимірюваних крапель жиру є недостатньо представленим середнім діаметром усіх крапель жиру. Тому ми вирішили визначити середній діаметр п’яти найбільших крапель жиру як параметр, пов’язаний з оборотом накопиченого жиру під час годування, GR та RF [50]. Детально, ріст клітин було ретельно реєстровано починаючи з Т0, використовуючи мікроскоп Nikon Eclipse TS100, обладнаний блоком управління мікроскопом Digital Sight (DS-L3) (Nikon). Після 14-го дня, кожного другого дня на зображенні випадковим чином вибирали приблизно 300 адипоцитів. Тим часом у кожному фігурі, що реєструється зі збільшенням 400 ×, на око відбирали п’ять найбільших крапель жиру на клітину та вимірювали їх діаметр. Якщо вибір оком був неможливий, вимірювали діаметри восьми найбільших крапель, а п'ять найбільших відбирали на основі виміряних значень. Нарешті, ми розрахували середній діаметр п'яти найбільших крапель жиру.

Фарбування олійно-червоним O (ORO)

Клітини двічі промивали PBS, потім інкубували з 3,7% формальдегідом протягом 1 години. Під час інкубації кількість адипоцитів визначали за допомогою растрового окуляра. Після промивання клітин Milli-Q та 70% етанолом рідина повністю відсмоктувалася. 0,5 грам масляного червоного O (Sigma-Aldrich) розчиняли в 50 мл ізопропанолу (Sigma-Aldrich), 30 мл цього розчину змішували з 20 мл води Milli-Q і фільтрували через пристрій 0,2 мкмоль/л. Аспіровані клітини фарбували цим робочим розчином ORO протягом 30 хв. Після фарбування клітини промивали 8 разів за 30 с 70% етанолом, потім двічі промивали Milli-Q протягом 5 хв і, нарешті, клітини розчиняли в 2 мл ДМСО (Sigma-Aldrich). Значення OD визначали при 540 нм. Значення ORO було скориговано для кількості клітинок наступним чином: Коригуване значення OD = (виміряне значення OD/кількість клітин) × 10 5 .

Виділення білка

Для виділення білка клітини збирали в кожну із зазначених вище часових точок як для контрольної, так і для дослідної групи. Детальніше, лунки з культивованими клітинами двічі промивали буфером PBS і лізували буфером SDT (2% додецилсульфат натрію/50 ммоль/л дитиотреїтолу/100 ммоль/л трис-HCl рН = 7,6), 300 мкл на лунку. Клітини зішкребали за допомогою скребка для клітин (Corning) і лізат збирали в пробірки, а потім нагрівали при 95 ° С протягом 5 хв. Після нагрівання зразки обробляли ультразвуком протягом трьох 20-ти циклів і центрифугували при 16000 × g протягом 5 хв при 20 ° C, а потім супернатант обережно переносили в іншу пробірку. Всі зразки зберігали при -80 ° C для перетравлення білка та LC-MS/MS. Весь експеримент проводили тричі, і для кожного експерименту було доступно по 3 лунки клітин для кожного виділення білка у всі моменти часу.

Підготовка та перетравлювання зразків білка

Відцентрові фільтруючі пристрої Amicon Ultra 0,5 мл (Sigma-Aldrich) замочували на ніч 5% -ним Твін 20. Фільтруючі пристрої промивали зануренням у Milli-Q на 10 хв при струшуванні 600 об/хв, потім додавали 500 мкл Milli-Q і фільтруючі пристрої центрифугували при 14000 × g при 20 ° C протягом 25 хв. Згодом блок фільтра вставляли у флакон для збору фільтрату. Зразок білка додавали у фільтрувальний блок, центрифугували при 14000 × g при 20 ° C протягом 30 хв. Після того як розчин у флаконі для збору викинули, фільтр перевернули і центрифугували при 2000 об/хв при 20 ° C протягом 2 хв.

Для алкілування 50 мкл концентрованого на фільтрі зразка змішували з 50 ммоль/л йодоацетаміду в обсязі 500 мкл і інкубували протягом 30 хв у темряві. Весь об'єм переносили у фільтруючий пристрій і центрифугували при 14000 × g при 20 ° C протягом 30 хв. Далі було здійснено кілька етапів видалення додецилсульфату натрію та дитиотрейтолу. 500 мкл 8 моль/л сечовини з додаванням 4% дезоксихолату натрію додавали у фільтруючий пристрій і центрифугували при 14000 × g при 20 ° C протягом 45 хв. Цей етап повторювали двічі з 500 мкл 8 моль/л сечовини, а потім двічі з 50 ммоль/л бікарбонату амонію. Далі концентрований зразок білка збирали шляхом інвертування фільтруючого блоку та центрифугуванням при 1000 × g протягом 5 хв. Концентрацію білка визначали за допомогою аналізу білка BCA на мікропланшеті згідно з протоколом виробника (Pierce, Thermo Fisher Scientific; 23252). Для перетравлення білка 42 мкг білка з часовими точками T14, T18, T18GR, T22RF доповнювали 1 мкг трипсину/суміші Lys-C (Thermo Fisher Scientific; V5073) та інкубували протягом 9–14 год при 37 ° C.

Зразок знесолення

Ідентифікація білка за допомогою LC-MS/MS

Прилад для нанопотокової ВЕРХ (Ultimate 3000, Dionex) був підключений в режимі он-лайн до мас-спектрометра Q Exactive (Thermo Scientific) з джерелом іонів нано-електророзпилювача Flex (Proxeon). Кінцева концентрація міченої ТМТ суміші дайджест/пептид становила 0,33 мкг/мкл, і 5 мкл цієї суміші завантажували на колону з оберненою фазою С18 (Thermo Scientific, колонка Acclaim PepMap C18, внутрішній діаметр 75 мкм x 15 см, 2 -мкм розмір частинок). Пептиди розділяли 120-хвилинним лінійним градієнтом 4–68% буфера B (80% ацетонітрилу та 0,08% мурашиної кислоти) при швидкості потоку 300 нл/хв.

Дані МС отримували за допомогою залежного від даних методу топ-10, динамічно вибираючи найпоширеніші іони-попередники зі сканування обстеження (280–1400 м/з) у позитивному режимі. Скани обстеження отримували з роздільною здатністю 70 000 та максимальним часом введення 120 мс. Тривалість динамічного виключення становила 30 с. Виділення попередників проводили з вікном 1,8 м/z та максимальним часом впорскування 200 мс. Роздільна здатність для спектрів HCD була встановлена на 30000, а нормалізована енергія зіткнення становила 32 еВ. Коефіцієнт недостатнього заповнення визначався як 1,0%. Прилад працював із увімкненим режимом розпізнавання пептидів, але виключення однозарядних іонів та зарядних станів перевищувало п’ять.

Пошук бази даних, кількісна оцінка, нормалізація та аналіз шляхів

Дані МС шукали, використовуючи пошукову систему Proteome Discoverer 2.2 Sequest HT (Thermo Scienti ﬁ c), проти людської бази даних UniProt. Швидкість помилкового виявлення (FDR) була встановлена на 0,01 для білків та пептидів, які мали мати мінімальну довжину шість амінокислот. Допуск маси попередника становив 10 ppm, а допуск фрагментів - 0,02 Da. Переносилося одне невдале розщеплення, окислення метіоніну було встановлено як динамічну модифікацію та карбамідометилювання цистеїнів, аддукти реагенту ТМТ (+229,162932 Да) на лізині та пептидні аміноконцеві встановлені як фіксовані модифікації. Дані кожного циклу нормалізували до загальної кількості пептиду в кожному каналі та для порівняння між циклами, масштабованими до часової точки T18. Кількісні зміни ідентифікованих білків використовувались для аналізу та візуалізації шляхів за допомогою програмного забезпечення PathVisio версії 3.3.0 [28,52].

Збір даних з дослідження in vivo

Для порівняння протеомічних змін in vitro та in vivo та подальшого вивчення можливого зв’язку із відновленням ваги з дослідження Yoyo було вилучено дані кількісної оцінки протеомів та аналізу мікрочипів 53 учасників людини (реєстраційний номер:> NCT01559415 [53],). Процес збору даних був показаний на блок-схемі (див. Додаткову рисунок 4). Коротше кажучи, дослідження Yoyo було дослідженням щодо зниження ваги/подальшого втручання на 61 людині із зайвою вагою/ожирінням. Здійснювали антропометричні вимірювання, а зразки, що включають біопсію жирової тканини, відбирали до схуднення (Т1), після (дуже) низькокалорійної дієти протягом 5 тижнів або 3 місяців, щоб втратити приблизно 8% маси тіла (Т2), через 4 тижні існування підтримується на збалансованому харчуванні (Т3) і після 9-місячного періоду спостереження (Т4). Кількісну оцінку білка та аналіз мікрочипів проводили, як описано раніше [54]. Зміни рівня РНК від Т1 до Т3 були отримані за даними аналізу мікрочипів. Дані про РНК при Т4 були недоступні. Зміни рівня білка від Т1 до Т4 були зібрані за даними кількісної оцінки білка.

Статистичний аналіз

Дані були представлені як середнє значення ± SEM. Статистичний аналіз проводили з використанням SPSS версії 22.0 для Windows 10 (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США). Зміна складки (FC) була розрахована під час подальшого годування, GR та RF відповідно. Всі змінні перевіряли на нормальний розподіл за допомогою тесту Шапіро-Вілька, Р> 0,05 вважали порогом нормального розподілу. Для змінних із нормальним розподілом використовували парний t-тест для порівняння значень у межах групи в різні моменти часу; незалежний t-тест був використаний для порівняння між контрольною групою та тестовою групою. Для змінних з косим розподілом використовували тест Вілкоксона. Коефіцієнти кореляції Спірмена Ро розраховували для залежностей між параметрами в різні моменти часу. У статистичному аналізі P (25M, zip)