Ранні зміни секреції та дії інсуліну, спричинені дієтою з високим вмістом жиру, пов’язані зі зниженням симпатичного тонусу

Анотація

Як відомо, надмірна вага та ожиріння є одними з основних факторів навколишнього середовища, відповідальних за метаболічний синдром, який може призвести до діабету 2 типу у схильних суб'єктів (7, 33, 34). Серед ранніх подій, що характеризують стани преметаболічного синдрому, часто спостерігається індукована глюкозою надмірна секреція інсуліну, пов'язана з резистентністю до інсуліну (15, 33). Цей період гіперсекреції інсуліну може супроводжуватися подальшим погіршенням секреції інсуліну у відповідь на глюкозу (панкреатична недостатність та встановлення діабету 2 типу; див. Посилання 14 та 15). Ці відхилення можуть бути пов'язані з порушенням метаболізму вільних жирних кислот (ЗЖЖ) (33), що, як відомо, сприяє погіршенню як секреції інсуліну (47), так і дії (13, 46).

З досліджень, проведених на різних моделях тварин, з’ясувалося, що пов’язана з дієтою надмірна вага з високим вмістом жиру (HF) викликає збільшення концентрації тригліцеридів у плазмі крові (TG) (6, 10, 11, 30) та/або ектопічне зберігання TG (5, 10 ), ситуація, яка може спричинити ліпотоксичність як на підшлунковій залозі (3), так і на периферичному рівні (10). З іншого боку, було висловлено припущення, що індукована дієтою дисфункція вегетативної нервової системи також може бути важливим компонентом станів передметаболічного синдрому (розглянуто в посиланнях 23 і 24). Наприклад, Левін (28) показав, що спостерігається знижений обмін норадреналіну (NE) в органах, включаючи мозок, у схильних до ожиріння щурів перед будь-яким збільшенням маси тіла. Крім того, висока поширеність ожиріння та діабету 2 типу в індійському співтоваристві Піма може бути наслідком "ощадливого генотипу", включаючи низьку симпатичну активність (40).

У цьому дослідженні нормальних щурів Wistar піддавали ВЧ-дієті для вивчення його коротко- та довгострокового впливу на секрецію та дію інсуліну. Ми виявили, що HF щури швидко виявляли гіперсекрецію інсуліну у відповідь на резистентність до глюкози та печінки (після 2-денної дієти), а потім непереносимість глюкози (7 днів) та втрата гіперсекреції інсуліну підшлункової залози (2 місяці). Крім того, ми мали на меті перевірити, чи може ВЧ дієта спричинити зміни в діяльності центральної нервової системи (ЦНС), зосередившись лише на самому початку дієти (2-й день), коли з’явилися зміни секреції та дії інсуліну. Дійсно, дисліпідемія часто асоціюється з дисфункцією вегетативної нервової системи (29, 47), і раніше вже було показано, що знижений симпатичний тонус може бути частково відповідальним за гіперсекрецію інсуліну у відповідь на глюкозу (31).

Тварини.

Експериментальний протокол був затверджений інституційним комітетом з догляду та використання тварин в Університеті Парижа 7. Самців щурів Wistar рандомізували у віці 6 тижнів у наступні дві групи: одна група отримувала стандартну лабораторну чау (113; UAR, Epinay sur Orge, Франція ) ad libitum та інша високочастотна дієта на основі сала (231H, UAR) ad libitum (HF щури). Харчова дієта містила 40% жиру (32,5% як сало та 7,5% як кукурудзяна олія) проти 4,5% для дієти чау, а загальні енергетичні показники становили 5100 та 3000 ккал/кг. Щурів поселяли індивідуально в клітках з нержавіючої сталі в приміщенні, що підтримувало температуру 24 ± 3 ° C з включеним освітленням з 7:00 до 19:00; вони мали вільний доступ до води.

Прийом їжі.

Щоденне споживання їжі вимірювали зважуванням гранул та ВЧ-дієтою між 9:00 та 10:00 ранку.

Індукована глюкозою секреція інсуліну.

Секрецію інсуліну у відповідь на глюкозу досліджували щодня після початку дієти протягом першої неділі, потім щотижня протягом решти 7 тижнів. Коротко кажучи, разову дозу глюкози вводили внутрішньочеревно (1 г/кг маси тіла) щурам, позбавленим їжі протягом 4 год. Зразки крові брали з каудальних судин в час 0, 5, 10, 15, 20, 30, і 60 хв після ін’єкції глюкози. Глікемію негайно вимірювали за допомогою аналізатора глюкози (Roche Diagnostics, Meylan, Франція). Потім плазму видаляли і зберігали при -20 ° C до отримання RIA інсуліну.

Щоб оцінити можливу участь змін симпатичної активності в контролі секреції інсуліну після 2-денної дієти, індуковану глюкозою секрецію інсуліну (GIIS) також вивчали у присутності агоніста α2A-адренорецепторів, оксиметазоліну (Sigma Chemical, St. Луї, Міссурі). Інсулінову відповідь тестували в присутності 0,1, 1, 10 та 1000 пмоль оксиметазоліну/кг маси тіла, вводили внутрішньочеревно за 5 хв до навантаження глюкозою. Ми виміряли інсуліногенний індекс від час 0 (навантаження глюкозою) до час 60 хв (кінець тесту). Точки часу становили 0, 5, 10, 15, 20, 30 та 60 хв. Кожна концентрація відповідала іншій групі щурів.

Норма обороту глюкози.

Вимірювання проводили в базальному стані та під час еуглікемічно-гіперинсулінемічних затискачів. Щурів, позбавлених їжі протягом 4 год, знеболювали пентобарбіталом натрієм (50 мг/кг в/в). Для забору крові в праву яремну вену ввели катетер. Інфузії (інсулін, мічена та немічена глюкоза) проводили за допомогою голок метеликів, які вводили в підшкірну вену.

Початкова доза [3- 3 H] глюкози (5 мкКі) вводилася через підшкірну вену через -50 хв з подальшою безперервною інфузією зі швидкістю 0,2 мкКі/хв протягом усього дослідження. Зразки крові відбирали через -15, -10 та 0 хв протягом базального періоду та в час 70, 80, і 90 хв під час стаціонарного евглікемічного затиску для оцінки швидкості утилізації глюкози.

Евглікемічно-гіперінсулінемічні затискачі.

Перед інфузією інсуліну відбирали два набори зразків крові для визначення рівня базальної глюкози в крові, інсуліну в плазмі та нестерифікованих жирних кислот (NEFA). Первинна доза інсуліну (20 мО Actrapid; Novo, Копенгаген, Данія), розчинена в ізотонічному сольовому розчині, вводилася через підшкірну вену з подальшою безперервною інфузією інсуліну (0,4 U · кг −1 · год −1) з постійною швидкістю 20 мкл/хв.

Під час затискачів кожні 5 хв відбирали кров для визначення гликемії та регулювання швидкості неміченої інфузії глюкози для підтримки евглікемії (глікемія від 4,5 до 6 мМ). Еуглікемічний затискач був досягнутий протягом 30–40 хв і підтримувався протягом 40 хв після цього. Стаціонарна питома радіоактивність глюкози та концентрації глюкози та інсуліну в плазмі крові визначали протягом останніх 20 хв затискача.

Аналітичні методи.

Глюкозу в крові визначали за допомогою аналізатора глюкози (Roche Diagnostics). Для аналізу радіоактивності [3- 3 H] глюкози зразки крові депротеїнізували Ba (OH) 2 і ZnSO4, а супернатант випарювали насухо при 50 ° C для видалення води, що тритіювала. Сухий залишок розчиняли в 0,5 мл води, до якої додавали 10 мл розчину Aqualuma плюс сцинтиляційний розчин (Lumac LSC, Гронінген, Нідерланди), і радіоактивність визначали в рідкій сцинтиляційній системі Packard Tri-Carb 460C. Інсулін у плазмі крові визначали за допомогою набору RIA (DiaSorin, Les Ullis, Франція). Концентрації NEFA вимірювали за допомогою ферментативного аналізу (тест NEFA-C; Wako Chemicals).

Кінетика глюкози та вираження даних.

У базальному стійкому стані швидкість появи глюкози (Ra, швидкість появи, що відображає вироблення глюкози в печінці) дорівнювала швидкості утилізації глюкози (Rd, швидкість зникнення, що відображає використання глюкози). Rd розраховували за формулою Rd = Ra = [3- 3 H] швидкість інфузії глюкози [дезінтеграції · хв -1 (dpm) · хв -1], поділена на питому активність глюкози в крові (dpm/mg), протягом останніх 20 хв затиску глюкози (50–70 хв після початку інфузії інсуліну). Результати подано як середнє значення ± SE.

Оболонка NE підшлункової залози, печінки та мозку.

Аналіз печінки: вміст глікогену і ТГ.

Печінку (0,2 г) подрібнювали у дистильованій воді за допомогою Ultraturax (крижано-холодна процедура), а потім TG аналізували в гомогенаті за допомогою комерційного набору "GPO trinder" (Sigma Diagnostic). Глікоген також вимірювали в гомогенаті, використовуючи метод Реріга та Олред (42); її гідролізували обробкою амілоглюкозидазою без попередньої екстракції, а глюкозу дозували колориметричним методом з використанням глюкозооксидази.

Процедура мікродіалізу.

Детальний опис хірургічних та технічних процедур був наведений раніше (43). Коротко кажучи, принаймні за 5 днів до експерименту тварину помістили в стереотаксичну рамку (Kopf Instruments). Була імплантована направляюча канюля для введення зонду для мікродіалізу з його верхньою частиною в паравентрикулярне ядро (PVN) гіпоталамуса і нижньою частиною в вентромедіальний гіпоталамус (VMH). Координати напрямного наконечника були (згідно з атласом Паксіноса та Ватсона; посилання 37a) -1,9 мм позаду брегми, 0,5 мм бічно та 7 мм черевно від твердої мозкової оболонки. Діалізний зонд виступав на 2 мм за напрямну трубку, а його кінчик досягав точки 9 мм вентрально від брегми. Направляюча канюля та венозний катетер були закріплені на черепі гвинтами з нержавіючої сталі та стоматологічним цементом.

У день експерименту система трубок, з'єднана з двоканальним вертлюгом, розміщеним на пучку, дозволяла вливати рідину в зонд і відбирати проби. Швидкість потоку (2 мкл/хв) дозволяла збирати зразки 30 мкл кожні 15 хв. Зонд для діалізу вводили через напрямну о 9:00 ранку, і інфузію проводили за допомогою розчину Рінгера, що містить 147 мМ Na +, 2,3 мМ Ca 2+, 4 мМ K + і 155,6 мМ Cl -. Перші зразки мікродіалізу брали через 4 год після введення зонда; ця затримка необхідна для досягнення стабільних рівнів катехоламіну. Після відбору чотирьох 15-хвилинних вихідних зразків щурів піддавали внутрішньочеревної ін’єкції глюкози (1 г/кг маси тіла). Відбір проб проводили кожні 15 хв після ін'єкції протягом принаймні 3 год.

Вимірювання NE гіпоталамуса.

Діалізати аналізували за допомогою рідинно-фазової хроматографії з зворотною фазою з електрохімічним детектуванням (Decade; Antec) при потенціалі 750 мВ. Хроматографічна система складалася з 20-мкл петлі зразка, що вела до 10-сантиметрової колони (Колохром) із внутрішнім діаметром 3,2 мм і упаковкою С18 3 мкм. Рухлива фаза складалася з ацетатного буфера, що містив 100 мкМ ЕДТА, 1 мМ октансульфонової кислоти та 4% об./Об. Ацетонітрилу при рН 3,1. Ця система дозволила виявити NE при чутливості 0,1 нА та відокремити його від інших моноамінергічних сполук.

Середні рівні NE в чотирьох вихідних зразках (до введення глюкози) були розраховані для кожної тварини. Відсоток варіацій щодо базових рівнів розраховували для кожної тварини в кожний момент часу. Потім результати виражали як середній відсоток базового рівня ± SE.

Статистичний аналіз.

Статистичний аналіз проводили за допомогою двофакторного повторного вимірювання ANOVA. Порівняння між контрольними та ВЧ щурами оцінювали неспареними студентами т-тест. P

Таблиця 1. Маса тіла, споживання їжі та показники базальної плазми через 2 дні, 1 тиждень та 8 тижнів після початку дієти

Значення є середніми ± SE. СН, дієта з високим вмістом жиру; FFA, вільна жирна кислота; ТГ, тригліцериди.

* P

Рис. 1.Часовий курс концентрацій глюкози та інсуліну у плазмі крові у відповідь на навантаження глюкозою у щурів, що годувались чау (пунктирною лінією) та щурів з високим вмістом жиру (суцільна лінія) після 2-денної дієти (A і B), 1 тиждень дієти (C. і D), і 8 тижнів дієти (Е і F). Значення - середні значення ± SE; n = 9 щурів/група. *P

GIIS у контрольних та ВЧ щурів через 2 дні дієти у присутності оксиметазоліну.

За відсутності оксиметазоліну (рис. 2) інсуліногенний індекс (ΔI/ΔG) був у 2,5 рази вищим у HF щурів порівняно з контролем через 2 дні дієти, що виражає гіперсекрецію інсуліну у відповідь на глюкозу (також показано на рис. 1, A і B). У HF щурам ін’єкція оксиметазоліну значно знижувала секрецію інсуліну у відповідь на глюкозу дозозалежним чином: ΔI/ΔG зменшувались на 24% порівняно з базовим значенням у присутності 0,1 пмоль/кг оксиметазоліну та значно зменшували на 65, 74 та 93% при наявності 1, 10 та 1000 пмоль/кг відповідно. Навпаки, у контрольних щурів ΔI/ΔG залишався незмінним, коли тваринам давали 0,1, 1 та 10 пмоль/кг оксиметазоліну, тоді як його зменшували на 74% у присутності 1000 пмоль/кг.

Рис.2.Інсуліногенний індекс (ΔI/ΔG) у відповідь на навантаження глюкозою у присутності зростаючих кількостей оксиметазоліну у контрольних (заповнених батончиків) та щурів з високим вмістом жиру (відкритих батончиків). *P

Глюкоза TR в базальних та еуглікемічно-гіперінсулінемічних затискачах.

На малюнку 3 показано TR глюкози як в базальних, так і в умовах гіперінсулінемічно-евглікемічного затиску у ВЧ щурів та щурів, яких годували чау, після 2-денної дієти. Базальний оборот був однаковим в обох групах. Під час гіперінсулінемічних затискачів концентрація інсуліну в плазмі крові була збільшена приблизно в шість разів вище базової величини в обох групах з інфузіями інсуліну 0,4 О · кг −1 · год −1. За цієї умови гіперінсулінемія була подібною в обох групах і досягала,5001 500 пМ (базальна концентрація інсуліну в обох групах становила ∼250 пМ). Індуковане інсуліном збільшення використання глюкози (тобто Rd) було подібним у щурів, що годували чау та ВЧ (рис. 3A); на відміну від цього, зменшення вироблення печінкової глюкози (тобто Ra) послаблювалось у HF щурів порівняно з контролем (рис. 3B). Отже, печінкова резистентність до інсуліну була присутня вже через 2 дні дієти із СН і зберігалася протягом усього дослідження (дані не наведені).

Рис.3.Швидкість обороту глюкози в базальному стані (заповнені бруски) та під час еуглікемічно-гіперинсулінемічних затискачів (відкриті бруски) у щурів, яких годували чау чи дієти з високим вмістом жиру. A: швидкість зникнення глюкози (Rd), тобто використання глюкози. B: швидкість появи глюкози (Ra), тобто вироблення глюкози в печінці. *P

Печінкові аспекти.

Через 2 дні ВЧ дієти спостерігалося значне збільшення вмісту печінкового ТГ (50,3 ± 3 мг/г печінки проти 31,7 ± 2,4 мг/г у щурів, що годували чау, P

Таблиця 2. NE0 у підшлунковій залозі, печінці та мозку, k та TR NE у щурів HF та контрольних груп

Значення є середніми ± SE. NE0, базальний рівень концентрації норадреналіну (NE); k, константа швидкості витоку NE; TR, коефіцієнт обороту.

* P

Рис.4.Відсоток вихідної концентрації позаклітинного норадреналіну через 30 хв після внутрішньовенного введення глюкози (1 г/кг маси тіла) у щурів з високим вмістом жиру (відкритий бар) та контрольних груп (заповнений брусок). NA, числова апертура. *P

Це дослідження демонструє, що високочастотна дієта швидко призводить до підвищення ІМСН (2 дні) та печінкової резистентності до інсуліну з подальшою непереносимістю глюкози (1 тиждень). Через 8 тижнів гіперсекреція інсуліну у відповідь на глюкозу більше не спостерігається, що можна пояснити нездатністю підшлункової залози підтримувати гіперсекрецію для довготривалої резистентності до інсуліну. Щури, піддані ВЧ-дієті, стали в значній мірі непереносимими глюкозою, але вони не виявляли базальної гіперглікемії або гіперінсулінемії. Більше того, через 60 хв після ін’єкції глюкози їх глікемія повернулася до рівня контрольних щурів (рис. 1), що вказує на те, що інсулін все ще досить ефективний для підтримки базальної нормоглікемії.

На закінчення, щури Wistar, піддані ВЧ-дієті, швидко виявили порушення регуляції секреції та дії інсуліну, що супроводжувалося модифікацією активності ЦНС і незалежно від підвищення периферичного TG або FFA. Непереносимість глюкози з’явилася протягом першого тижня дієти і погіршилась, тоді як гіперсекреція інсуліну у відповідь на глюкозу зменшилася. Таким чином, ця модель може бути зручною для вивчення індукованої дієтою інсулінорезистентності та непереносимості глюкози, особливо для оцінки, за допомогою яких механізмів дієтичне перевантаження ліпідів може впливати на активність ЦНС та порушувати гомеостаз глюкози цим непрямим способом.