Межі в мікробіології

Харчова мікробіологія

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Безпека харчових продуктів та збудник харчових продуктів - глобальна перспектива різноманітності, боротьба з стійкістю до різних лікарських засобів та управління ними Переглянути всі 39 статей

Редаговано
Дізнайся-Хан Лі

Університет Монаш, Малайзія, Малайзія

Переглянуто
Серхіо Е. Пастеріс

Національний університет Тукумана, Аргентина

Костянтинос Пападімітріу

Департамент харчової науки та технологій, Пелопоннеський університет, Греція

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

прикордонні

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Департамент харчових біотехнологій, відділення для північно-західного та західного регіону, Науково-дослідний інститут сільськогосподарських біотехнологій, Організація освіти та розвитку (AREEO), Тебріз, Іран
  • 2 БАД та Центр досліджень пробіотиків, Університет медичних наук Альборза, Карадж, Іран

Вступ

Ентерококи належать до родів молочнокислих бактерій (LAB). Вони є грампозитивними, каталазонегативними, коккоподібними, факультативними анаеробами та неспороутворюючими бактеріями (Haghshenas et al., 2016). На основі філогенетичних доказів та молекулярних досліджень (секвенування 16S-рДНК або гібридизація ДНК – ДНК) до цього роду було класифіковано понад 26 видів. Ці мікроорганізми є всюдисущими бактеріями, які є загальною мікробіотою в кишечнику людей, ссавців та інших тварин, шлунково-кишкових шляхах, але вони також є в грунті, воді, рослинних продуктах, м'ясі, ферментованому та вареному м'ясі та молочних продуктах (Li et al. ., 2018; Zommiti та ін., 2018). Це пов’язано з їх високою толерантністю до суворих умов, таких як високі температури, низький рН та висока солоність. Значна роль Росії E. faecium, E. faecalis, і E. durans у процесі дозрівання традиційних сирів показали, що ентерококи відіграють важливу роль у дозріванні цих сирів, ймовірно, шляхом протеолізу, ліполізу та розпаду цитратів, що сприяє їх типовому смаку та смаку. У більшості робіт це зазначено Ентерокок ізоляти відіграють життєво важливу роль у розвитку сенсорних властивостей ферментованих продуктів, таких як оливки (вони розщеплюють олевропеїн у ферментованих маслинах), ковбас та сиру (Морено та ін., 2006).

В основному існують різні масиви пробіотиків Лактобактерії і Біфідобактерії групи та Ентерокок останні роки використовуються у функціональних продуктах харчування (Haghshenas et al., 2017). Заявленими перевагами пробіотичних ентерококів є: (i) лікування діареї або діареї у поєднанні з антибіотикотерапією, вірусними забрудненнями, хіміотерапією та захворюваннями, що походять від харчових патогенів (Lau and Chamberlain, 2016); (ii) стримування росту патогенних бактерій (Zorriehzahra et al., 2016); (iii) антимутагенні та антиканцерогенні особливості; (iv); підвищений бар'єр слизової оболонки кишечника (Ahl et al., 2016); (v) стимуляція імунної системи (Sheikhi et al., 2016); (vi) профілактика виразок, пов'язаних з хелікобактер пілорі інфекція (Oh et al., 2016) та (vii) асиміляція холестерину в їжі та кишечнику людини (Kobyliak et al., 2016). Ці мікроорганізми мають антагоністичну активність через збудників різних антимікробних сполук. Виробництво включає бактеріоцини, молочну та оцтову кислоти та перекис водню.

Матеріали і методи

Відбір проб та умови культури

Кустарні молочні продукти (йогурти, сир та сир) збирали у вітчизняних виробників (табл. 1). Зразки транспортували до лабораторії в крижаних коробках і зберігали при 4 ° C. Для кращого відокремлення бактерій від твердих частинок йогурту та сиру первинна гомогенізація відбувалася за допомогою вихрового змішування. Для приготування бактеріальної суспензії йогурту 10 г йогурту переносили в 100 мл стерильної фізіологічної пептонової води і обережно струшували. Для приготування бактеріальної суспензії сиру та сиру 20 г кожної проби суспендували у 180 мл стерильного розчину тринатрію цитрату, а через півгодини 10 мл приготованого розчину додавали до 200 мл де Ман Рогоза Шарп (MRS). ) бульйон для збагачення та посилення початкової популяції бактерій в анаеробних умовах та інкубації при 37 ° C протягом 24 годин (Haghshenas et al., 2017).

Таблиця 1. Походження, регіон підготовлених зразків та переносимість ізолятів на кислоту та жовч.

Ізоляція Ентерокок Ізоляти

Ентерокок ізоляти виділяли методом смугастих пластин на агарі MRS та інкубували аеробно при 37 ° С протягом 24 годин. Поодинокі колонії регулярно перевіряли на чистоту мікроскопічним дослідженням. Чисті колонії використовувались для характеристики фарбування за Грамом та тесту на каталазу. Колонії, які були грампозитивними та каталазонегативними, відбирали та інокулювали у відвар MRS, що містить 30% гліцерину в якості кріопротектора, і зберігали при -80 ° C (El Soda et al., 2003). Очищені культури перед використанням активували шляхом подкультививання двічі у відварі MRS.

Оцінка властивостей пробіотиків

Толерантність до кислоти та жовчних солей

Для визначення кислотостійкості 10 мл бактеріальної культури кожного зразка інкубували протягом 24 годин у відварі MRS. Відібрані колонії переносили в мінеральний розчин, забуференний фосфатом, сольовий розчин (PBS, pH 2,5). Зразки інкубували аеробно протягом 3 год при 37 ° С. Потім клітини розбавляли до 10 разів за допомогою стерильного фізіологічного розчину (хлорид натрію: 5,8 г/л) і культивували кожне розведення 100 мкл для поверхні агару MRS у культуральному середовищі. Зразки інкубували аеробно протягом 48–72 год при 37 ° C (Haghshenas et al., 2015).

Толерантність до жовчних солей була проаналізована на основі методу, використовуваного раніше Намі та співавт. (2015b). Коротко, культуральне середовище для бульйону MRS, як контроль, та MRS з 0,3% жовчного оксигалу, що використовувались як тест-середовище (обробки), інокулювали одночасно 1% активної бактеріальної культури при 37 ° C протягом 4 годин. Оптичні щільності росту контрольних та оброблених культур вимірювали спектрофотометром (Еппендорф, Німеччина) при 600 нм. Відсоток придушення росту вимірювали за такою формулою:

Антимікробна активність та виявлення бактеріоцину

Для висновку та розпізнавання інгібуючих метаболітів, що виробляються, був проведений метод дифузійної свердловини Ентерокок ізоляти (Nami et al., 2015a). Культури відібраних ізолятів протягом ночі культивували в агарі MRS при 37 ° C протягом 24 годин. Індикаторними бактеріями, використаними в цьому дослідженні, були Shigella flexneri PTCC 1234, Золотистий стафілокок ATCC 25923, Listeria monocytogenes ATCC 13932, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Klebsiella pneumoniae PTCC 1053, кишкова паличка PTCC, 1276 та Bacillus subtilis ATCC 19652. Ці патогенні організми були придбані у колекції культури перських типів (PTCC) для виявлення антагоністичних речовин. Половину індикаторних бактерій McFarland (1,5 × 10 8 КУО/мл) виливали на агар Мюллера-Хінтона і лунки розрізали на тарілки. Потім кожну лунку заповнювали 50 мкл відфільтрованого надосадової рідини та планшети, витримані протягом ночі при температурі 37 ° C, і нарешті, зону гальмування навколо лунок вимірювали цифровими штангенциркулями.

Оцінювали білковий характер гальмування. З цією метою активні безклітинні супернатанти культури отримували центрифугуванням при 15000 об/хв протягом 12 хв при 4 ° С. Їх піддавали різним ферментним обробкам, включаючи каталазу, трипсин, α-хімотрипсин та протеїназу К, у дозі 1 мг/мл при 37 ° С протягом 2 год, після регулювання рН на 6,2 за допомогою 1 М NaOH. Потім оцінювали залишкову активність щодо патогенних мікроорганізмів. Чутливість протеази визначалася відсутністю зон інгібування навколо лунок. Для підтвердження присутності перекису водню активні супернатанти піддавали стерилізованій каталазі (1 мг/мл) та інкубували при 37 ° C протягом 2 годин і, нарешті, їх діяльність оцінювали методом дифузійної свердловини.

ПЛР-ампліфікація відомих генів ентероцину

Всі структурні гени стосуються експресії добре відомих ентероцинів EntA, EntB, EntP, EntL50A, EntL50B, Ent31 (Тойт та ін., 2000), EntQ (Belgacem та ін., 2010), та Ent1071 (Omar et al., 2004) були ампліфіковані специфічними праймерами ПЛР (табл. 2). ПЛР-ампліфікацію проводили при кінцевому обсязі 50 мкл, який складався з 1 буфера полімерази Taq, 200 мкМ dNTP, 25 мкМ кожного праймера, 2 мкл матричної ДНК (запас) та 1 одиниці ДНК полімерази Taq (Thermo Fisher Scientific, Сполучені Штати). Продукти ПЛР візуалізували електрофорезом на 2% агарозних гелях.

Таблиця 2. Праймери, що використовуються для ПЛР-ампліфікації факторів вірулентності та генів виявлення ентероцину у штамів Enterococcus.

Виробництво екзополісахаридів (EPS)

Метод, використаний Fguiri та співавт. (2016) був використаний для оцінки здатності ізолятів продукувати EPS. Коротко кажучи, культури наносили на агарне середовище m-MRS, яке модифікували заміною глюкози на 100 г/л сахарози та інкубували при 37 ° С протягом 24 годин аеробно. Металева петля використовувалася для перетягування сформованих колоній. Якщо довжина слизу була вище 1,5 мм, ізолят вважався позитивним слизовим продуцентом.

Гідрофобність клітинної поверхні

Адгезійну здатність ізолятів до ксилолу визначали, як описано раніше у Mishra and Prasad (2005).

Автоагрегація та коагрегація

Здатність ізолятів до самоагрегації проводили згідно з методикою, описаною Angmo et al. (2016). Відсоток автоагрегації визначали, використовуючи таке рівняння:

Де A0 являє собою поглинання при t = 0, а A являє собою поглинання в момент часу t.

Спільна агрегація Ентерокок ізоляції проти семи патогенних мікроорганізмів проводили при 37 ° C через 4 год інкубації на основі методу, використаного Zuo et al. (2016). Відсоток спільної агрегації розраховували на основі рівняння:

Здатність до адгезії до кишкових клітин людини

Адгезійну здатність до клітин карциноми товстої кишки людини (Caco-2) оцінювали, як повідомляли раніше Nami et al. (2014). Коротко, для культивування клітин людини використовували середовище Меморіального інституту Розуелл Парку (RPMI-1640; Sigma), доповнене 10% інактивованою тепловою фетальною бичачою сироваткою. Клітини культивували на 24-лункових планшетах для культури тканин та інкубували при 37 ° С у 5% СО2 у відносно вологій атмосфері до досягнення конфлюентного моношару. Життєздатні клітини Caco-2 підраховували в камері гематоцитометра Беркера. Потім суспензію клітин, що включає бактерії та клітини Сако-2, піддавали чистої пластини для визначення C. адгезія бактерій виражалася як загальна кількість бактерій, приєднаних до життєздатних клітин Caco-2.

Асиміляція холестерину

Відсоток виведення холестерину визначали методом о-фталальдегіду, описаним Rudel and Morris (1973), з деякими змінами. Свіжоприготовлений відвар MRS доповнювали 0,3% оксгалом (Merk, Німеччина), оскільки жовчну сіль та водорозчинний холестерин (150 мкг/мл) додавали як джерело холестерину (стерилізували 0,2 мкл фільтру), суміш засівали кожним ізолятом при 1% -ний рівень та інкубують анаеробно при 37 ° C протягом 20 год. Клітини видаляли центрифугуванням (10000 об/хв протягом 15 хв) після періоду інкубації; згодом 1 мл безклітинного відвару змішували з 1 мл КОН (33% мас./об.) і 2 мл етанолу 96%, перемішували на вортексі протягом 2 хв з наступним нагріванням при 60 ° С протягом 15 хв. Суміші, охолоджені при кімнатній температурі, додавали 2 мл дистильованої води та 3 мл гексану і перемішували на вортексі протягом 1 хв. Один мл шару гексану переносили у скляну пробірку і випаровували на водяній бані при 80 ° C. Залишок негайно розчиняли у 2 мл o-фталальдегідний (Merck, Німеччина) реагент, після чого 0,5 мл концентрованої сірчаної кислоти і повністю вихрово протягом 1 хв. Зразки інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хв і, нарешті, поглинання зчитували при 550 нм.

Активність β-галактозидази

активність β-галактозидази Ентерокок ізолятів оцінювали згідно з Angmo та співавт. (2016). Посіви бактерій наносили на агарові пластини MRS, що містять 60 мкл X-gal (5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактопіранозид) та 10 мкл IPTG (ізо-пропіл-тіо-β-D-галактопіранозид ) розчин як індуктор. Наявність активності β-галактозидази у штамах визначали через 42 год інкубації при 37 ° С.

Оцінка безпеки

Гемолітична активність

Гемолітична активність Ентерокок ізоляти досліджували культивуванням свіжих культур на ніч на агарових пластинах Колумбії (Oxoid), що містять 7% (об/об) овечої крові (Oxoid), та інкубували протягом 48 год при 37 ° C. Нарешті, гемолітичну активність виявляли 3 категорії: поява ореолу навколо колонії: зеленувата зона, що розглядається як α-гемоліз, чітка зона для β-гемоліз і відсутність гало для γ-гемолізу (Abedi et al., 2018).

Гідроліз жовчних солей

Гідроліз жовчної солі оцінювали згідно Argyri та співавт. (2013). Активність гідролізу вказувала 0,5% (мас./Об.) Тауродезоксихолевої кислоти через 48 год інкубації при 37 ° С. Активність гідролізу оцінювали шляхом утворення навколо колоній непрозорих агарових ореолів.

Виявлення факторів вірулентності

ПЛР-ампліфікацію проводили для виявлення генів, що кодують потенційні фактори вірулентності. Загальну бактеріальну ДНК виділяли методом, описаним Leenhouts et al. (1990). У цьому дослідженні були оцінені гени вірулентності cylA, clyB, esp, gelE, asa1, Ace, efaAfs, і cpd. E. faecium В якості контролю використовували ATCC 51299. ПЛР-ампліфікацію проводили для виявлення генів, що кодують ці фактори, за допомогою декількох праймерів (табл. 2). ПЛР-ампліфікацію проводили в реакційних пробірках по 0,2 мл, кожна з 25 мкл сумішей, використовуючи 0,1 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатів, 2,5 мМ MgCl2, 0,5 мМ кожного праймера, ПЛР-буфер (1X), 2 U Taq полімерази та 50 нг/мкл матриці ДНК. ПЛР-ампліфікації проводили з циклом початкової денатурації (94 ° С протягом 5 хв), після чого 32 цикли денатурації (94 ° С протягом 60 с), відпалу при відповідній температурі (Таблиця 2) протягом 60 с і подовження (72 ° С протягом 5 хв). Продукти ПЛР аналізували за допомогою гель-електрофорезу в 1,5% агарозі, забарвленій бромідом етидію (0,5 г/мл).

Сприйнятливість до антибіотиків

Тест на чутливість до антибіотиків проводився на основі раніше описаного методу Haghshenas et al. (2014). Коротко, було проведено аналіз дифузії диска для визначення чутливості ізолятів до антибіотиків. Для цього тесту було використано агарне середовище MRS. Антимікробні диски (5 мм) були придбані у компанії Padtan Teb Co, Іран. Випробовуваними антибіотиками були ванкоміцин (30 мкг), колістин (10 мкг), стрептоміцин (10 мкг), цефепім (30 мкг), цефіксим (15 мкг), сульфаметоксазол (2 мкг), канаміцин (30 мкг), ципрофлоксацин (5 мкг) ), тетрациклін (30 мкг), еритроміцин (15 мкг), ампіцилін (10 мкг), гентаміцин (10 мкг), кліндаміцин (30 мкг), цефтріаксон (30 мкг), хлорамфенікол (30 мкг) і цефалексин (30 мкг), використовуючи метод дифузійного диску. Після інкубації протягом ночі при 37 ° C вимірювали діаметр гальмування (мм) навколо кожного диска.

Секвенування генів 16S-рДНК

Ампліфікацію гена 16S-рДНК (1500 п.н.) ізоляту проводили з використанням пари специфічних для молочнокислих бактерій (LAB) універсальних праймерів (Hal6F/Hal6R) (F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ′ і R: 5 ′ -TACCTTGTTAGGACTTCACC-3 ′), раніше описані Haghshenas et al. (2016). Ампліфікацію ПЛР проводили для загального обсягу 50 мкл за таких умов: початкова денатурація при 94 ° C протягом 5 хв, потім 35 циклів денатурації при 94 ° C протягом 45 с, відпал при 59 ° C протягом 60 с, розширення при 72 ° C протягом 90 с, і завершальна стадія розтягування при 72 ° C протягом 10 хв. Продукти ПЛР візуалізували за допомогою електрофорезу 1% (мас./Об.) Агарозного гелю (Sigma Chemical Co., Пул, Великобританія) та фарбували бромідом етидію. Продукти ПЛР направляли до Служби секвенування ДНК макрогенів (Корея) для їх послідовності. Вирівнювання кількох послідовностей генів 16S рРНК проводили за допомогою функції CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) із параметрами за замовчуванням, а філогенетичне дерево генів 16S рРНК реконструювали за допомогою методу приєднання сусідів (Saitou and Nei, 1987) в програмному забезпеченні MEGA X (Kumar та ін., 2018) з параметром відстані p-відстані. Значення початкової стрічки розраховували за допомогою 1000 повторних зразків. Послідовність гена 16S рРНК Lactobacillus acidophilus (LC064893.1) був використаний як вихідна група для аналізу.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз даних проводили за допомогою SPSS (версія 19.0 SPSS, Чикаго, Іллінойс, США). Порівняння відмінностей між засобами лікування було проаналізовано одностороннім ANOVA на рівні значущості P a-g Засоби одного кольору з різними малими літерами суттєво відрізнялись (p Ключові слова: Ентерокок, пробіотичні властивості, молочні продукти, низький рівень холестерину, антимікробна активність, оцінка безпеки, ентерокок як пробіотики, фактори вірулентності

Цитування: Nami Y, Vaseghi Bakhshayesh R, Mohammadzadeh Jalaly H, Lotfi H, Eslami S and Hejazi MA (2019) Пробіотичні властивості Ентерокок Ізольовані від кустарних молочних продуктів. Спереду. Мікробіол. 10: 300. doi: 10.3389/fmicb.2019.00300

Отримано: 26 вересня 2018 р .; Прийнято: 04 лютого 2019 р .;
Опубліковано: 26 лютого 2019 р.

Learn-Han Lee, Університет Монаш, Малайзія, Малайзія

Серхіо Енріке Пастеріс, Національний університет Тукумана, Аргентина
Костянтинос Пападімітріу, Афінський сільськогосподарський університет, Греція