Поліфеноли зеленого чаю покращують раннє пошкодження нирок, спричинене дієтою з високим вмістом жиру, шляхом кетогенезу/шляху SIRT3

Вейцзе Йі

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

зеленого

2 Ключова лабораторія МНС з навколишнього середовища та здоров'я, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і технологій Хуачжун, Ухань 430030, Китай

3 Департамент харчування та гігієни продуктів харчування, Школа громадського здоров'я та менеджменту, Медичний університет Біньчжоу, Яньтай 264003, Китай

Сяо Се

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Міїнг Ду

4 Кафедра готельного менеджменту, Університет туризму, Гуйлінь 541000, Китай

Йонджун Бу

5 Кафедра харчування та гігієни продуктів харчування, Медичний університет Сіньсян, Сіньсян 453000, Китай

Наннань Ву

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Хуей Ян

6 Народна лікарня Кеченг, Кучжоу 324000, Китай

Чонг Тянь

7 Школа медсестер, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Фангі Сю

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Сіюн Сян

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Півей Чжан

8 кафедра клінічного харчування, лікарня Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань, Хубей 430030, Китай

Чжуо Чень

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Сюечжо Цзуо

8 кафедра клінічного харчування, лікарня Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань, Хубей 430030, Китай

Ченцзян Ін

1 Департамент харчування та гігієни харчування, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і техніки Хуачжун, Ухань 430030, Китай

2 Ключова лабораторія МНС з навколишнього середовища та здоров'я, Школа громадського здоров'я, Медичний коледж Тунцзи, Університет науки і технологій Хуачжун, Ухань 430030, Китай

Пов’язані дані

Анотація

Сфера дії

У кількох літературних звітах висловлено думку про ретропротекторну дію кетонових тіл та поліфенолів зеленого чаю (ГТФ). Наше попереднє дослідження показало, що споживання ГТФ може підвищити ниркову експресію кетогенного ферменту, що обмежує швидкість, що було зменшено завдяки дієті з високим вмістом жиру (HFD) у щурів. Тут ми дослідили, чи може кетогенез опосередковувати повторну захист GTP проти HFD.

Методи та результати

Щурів Wistar годували стандартно або HFD із або без GTP протягом 18 тижнів. Виявлено рівень окисного стресу в нирках, функцію нирок, експресію нирок та рівні активності мітохондріальної 3-гідрокси-3-метилглутарил-КоА (HMG-CoA) синтази 2 (HMGCS2) та сиртуїну 3 (SIRT3). Підвищений нирковий окислювальний стрес та втрата функції нирок, спричинені HFD, були покращені GTP. Нирковий кетогенез та рівні експресії та активності SIRT3, які були знижені HFD, були відновлені за допомогою GTP. In vitro клітини HEK293 трансфікували еукаріотичною експресійною плазмідою pcDNA HMGCS2. Лікування GTP може збільшити регуляцію експресії HMGCS2 та SIRT3. Хоча трансфекція HMGCS2 не впливала на експресію SIRT3, рівень 4-гідрокси-2-ноненального (4-HNE) та співвідношення ацетил-MnSOD (K122)/MnSOD знижувались у трансфікованих HMGCS2 клітинах у контексті H2O2.

Висновок

Кетогенез/шлях SIRT3 опосередковує повторний захист GTP проти окисного стресу, викликаного HFD.

1. Вступ

Кетогенез виникає під час тривалих фізичних навантажень, голодування, обмеження калорій (CR) або низького вмісту вуглеводів та високого рівня споживання ліпідів. Нещодавно позитивні ефекти кетогенезу були описані з точки зору втрати ваги [1], нейропротекції [2, 3], гепатопротекції [4] та повторної захисту [5–7]. Хоча точні механізми цих ефектів незрозумілі, прийнято вважати, що сприяння енергетичним витратам та рівновазі та/або зменшенню активних форм кисню (АФК) сприяють цим перевагам кетогенезу.

Епідеміологічні дослідження та експерименти на тваринах показали, що режим харчування та дієтичні компоненти можуть модулювати ниркову васкуляризацію та функції [12, 13]. Довготривала дієта з високим вмістом жиру (HFD) може призвести до окисного стресу, фіброзу та запалення, в кінцевому підсумку викликаючи функціональні та патологічні пошкодження нирок [13]. Крім того, ожиріння та порушення обміну речовин, які, як правило, пов’язані із споживанням жиру, призводять до більш високого ризику пошкодження нирок [14]. Навпаки, CR та фітохімікати були перевірені для захисту нирок від окисного стресу [5]. Наші попередні дослідження встановили, що експресія HMGCS2 була збільшена в печінці, але знижена в нирках в контексті HFD. Однак лікування поліфенолом зеленого чаю (GTP) може збільшити регуляцію експресії HMGCS2 в нирках, що є ефектом, подібним до ефекту голодування [8, 15]. Отже, ми припускали, що на відміну від CR, кетогенез, індукований HFD, може мати тканинну специфічність, а ниркова недостатність, індукована HFD, може бути частково обумовлена ​​зниженим нирковим кетогенезом. Крім того, подібно до CR, лікування ГТФ може захистити нирку шляхом сприяння кетогенезу.

Мітохондріальний сиртуїн 3 (SIRT3), нікотинамід-аденин-динуклеотид-залежний гістон-деацетилаза, пов'язаний з антиоксидацією CR і може покращити активність HMGCS2 за допомогою деацетилювання. КБ були перевірені, щоб підвищити співвідношення NAD +/NADH у нейронах, згодом збільшивши антиоксидантну активність SIRT3 [16]. Однак, чи існує подібний механізм у нирках, не було відомо. Насправді SIRT3 рясно експресується в нирках і може захищати проксимальні канальцеві клітини від ліпотоксичності, спричиненої пальмітатом, посилюючи окислювальну здатність мітохондрій та антиоксидантний захист [17]. Крім того, повідомляється, що GTP та епігалокатехінгалат (EGCG, основний компонент GTP) збільшують експресію SIRT3 [18]. На підставі вищезазначених фактів ми висунули гіпотезу про те, що SIRT3 може брати участь у відновленні захисту кетогенезу. Отже, в цьому дослідженні досліджено повторний захист ГТФ проти ВЧД та роль кетогенезу/SIRT3 у цих процесах.

2. Матеріали та методи

2.1. Лікування тварин

2.2. Культура клітин та лікування

Клітини ембріональної нирки 293 людини (HEK 293) були отримані з Банку клітин Китайської академії наук (Шанхай, Китай). Клітини HEK293 культивували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (DMEM)/високому вмісті глюкози, що містить 10% фетальної бичачої сироватки, і доповнювали пеніциліном/стрептоміцином у 5% СО2 при 37 ° C. Плазміди були придбані у компанії Vigene Biosciences. Після екстракції та перевірки проводили трансфекцію плазмідної pcDNA HMGCS2 з використанням реагенту для трансфекції Lipofectamine 3000 згідно з інструкціями виробника. Трансфіковані клітини обробляли GTP (4 мкг/мл, 24 години) або H2O2 (0,1 мМ, 6 годин) окремо.

2.3. Реагенти

GTP (91,21% катехінів та 71,72% EGCG) були придбані у Corona Science & Technology Development Co. Ltd. (Фу Чжоу, Китай). Кроличі поліклональні антитіла (анти-MnSOD, анти-HMGCS2, анти-Nampt та антикаталаза) були придбані у компанії Santa Cruz Biotechnology Inc. (Санта-Крус, США). Анти-FOXO3a та анти-SIRT3 антитіла були від Cell Signaling Technology Inc. (Данверс, США). Анти-SOD2/MnSOD (ацетил K122) та анти-4-HNE антитіла були від компанії Abcam Inc. (Кембридж, Великобританія). Загальний холестерин (ТК), тригліцериди (ТГ), ліпопротеїн-холестерин високої щільності (ЛПВЩ), ліпопротеїн-холестерин низької щільності (ЛПНЩ) та глюкоза крові були виявлені за допомогою наборів від BioSino Bio-Technology & Science Inc (Пекін, Китай). Набори ІФА для кількісного вимірювання сироваткового цистатину С та інсуліну були від Biovendor Inc. (Гейдельберг, Німеччина) та Mercodia AB (Уппсала, Швеція). Набори для аналізу креатиніну та N-ацетил-β-D-глюкозамінідази (NAG) були придбані в Інституті біоінженерії Нанкін Цзяньчен (Цзянсу, Китай). DMEM/високий рівень глюкози був придбаний у Gibco Inc. (Нью-Йорк, США). Реагент для трансфекції ліпофектаміну 3000 був від Invitrogen Inc. (Каліфорнія, США).

2.4. Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози та тест на толерантність до інсуліну

Для IPGTT щури голодували протягом 12 годин і згодом отримували внутрішньочеревну ін’єкцію глюкози (2 г/кг маси тіла). Рівні глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60 та 120 хвилин після ін’єкції за допомогою глюкометра (ACCU-CHEK Performa, Roche). Для ІТТ щурам вводили внутрішньочеревно рекомбінантний людський звичайний інсулін (0,8 ОД/кг маси тіла) після голодування протягом 6 годин. Концентрацію глюкози в крові контролювали через 0, 30, 60, 90 та 120 хвилин після ін’єкції, все ще використовуючи глюкометр. Площа під кривою була розрахована шляхом трапецієподібного підсумовування.

2.5. Біохімічний аналіз сироватки крові

Зразки крові збирали після витримки протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хвилин для відділення сироватки. Глюкоза в сироватці крові, TG, TC, LDL-C, HDL-C та інсулін аналізували за допомогою комерційних наборів згідно з протоколами виробників.

2.6. Гістологія та імуногістохімія

Коротко, парафінові зрізи нирок, товщиною приблизно 3-4 мкм, фарбували гематоксилін-еозином після депарафінізації та регідратації. Для імуногістохімічного фарбування нирок депарафінізовані та регідратовані зрізи блокували бичачим сироватковим альбуміном (BSA) після отримання антигену та блокували ендогенну пероксидазу, а потім інкубували з 4-HNE антитілом при 4 ° C протягом ночі. Після інкубації з міченим пероксидазою хрону (HRP-) вторинним антитілом коза-кролик, зрізи фарбували 3,3′-діамінобензидином (DAB). Середню оптичну щільність аналізували за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus.

2.7. Оцінка функції нирок

У 17 та 18 тижнів усіх тварин поселяли індивідуально в метаболічні клітини для збору зразків сечі протягом 24 годин. Зразки центрифугували при 3000 × g протягом 10 хвилин для видалення зважених частинок, а потім зберігали в аликвотах при -80 ° C. Рівні креатиніну, активність NAG у сечі та цистатин С у сироватці крові вимірювали за допомогою ферментативних аналізів. Рівні мікроальбуміну в сечі вимірювали за допомогою аналізатора BioSystems A25 (BioSystems, Іспанія). Швидкість кліренсу креатиніну (Ccr) розраховували за такою формулою: Ccr (мл/год/100 г маси тіла) = [креатинін у сечі (мг/дл) × об’єм сечі (мл/год)]/[креатинін у сироватці крові (мг/дл) × маса тіла (г)/100].

2.8. Імуноблоттинговий аналіз

Тканини кори нирок лізували за допомогою буфера радіоімунопреципітаційного аналізу (RIPA) (Beyotime, Шанхай, Китай), а білки кількісно визначали за допомогою методу біцинхонінової кислоти (BCA) (Beyotime, Шанхай, Китай). Білкові лізати (10–50 мкг) електрофорезували на SDS-поліакриламідних гелях та електротрансформували до мембран полівінілідендифториду (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, США). Після блокування протягом 1 години 10% знежиреного молока мембрани промивали та інкубували з первинним антитілом протягом ночі при 4 ° C з наступною інкубацією з кон'югованим HRP другим антитілом протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім білки візуалізували, використовуючи реагенти для детектування блоттингу ECL (Millipore, Billerica, MA, США). GAPDH або β-актин служили внутрішнім контролем.

2.9. Рівні активності MnSOD, CAT, загальної SOD та Cu/Zn SOD та рівні MDA, NAD та β-гідроксибутират у корі нирки та сироватці крові

Активність MnSOD, CAT, загального SOD та Cu/Zn SOD та рівні MDA у корі нирки аналізували за допомогою комерційних наборів відповідно до вказівок виробників (Інститут біоінженерії Нанкін Цзяньчен, Цзянсу, Китай).

Рівні NAD (BioVision, Сан-Франциско, США) та β-гідроксибутирату (Кайман, Мічиган, США) у корі нирки та сироватці крові були виявлені за допомогою комерційних наборів відповідно до інструкцій виробника.

2.10. Статистичний аналіз

Таблиця 1

Вплив ГТФ на вагу та біохімічні показники крові в різних групах щурів (χ ± s, n ≥ 5).

CONCON + GTPsHFDHFD + GTPs
Початкова вага (г)195,00 ± 8,17192.50 ± 10.51193.80 ± 7.51192.80 ± 12.60
Кінцева вага (г)530,80 ± 16,65527,10 ± 24,50606,30 ± 24,18 ∗ 562,40 ± 55,02 #
Споживання їжі (г/день)27,05 ± 1,8427,66 ± 1,6820,62 ± 1,09 ∗ 20,96 ± 0,94
Споживання енергії (ккал/добу)89,30 ± 6,2891,61 ± 5,6892,52 ± 5,1294,07 ± 4,26
Маса вісцерального жиру (г)13,57 ± 0,8916,42 ± 4,8229,41 ± 8,66 ∗ 20,99 ± 6,43 #
Вісцеральний коефіцієнт жиру2,62 ± 0,253,14 ± 0,785,00 ± 1,24 ∗ 3,82 ± 0,99 #
Вага нирки (г)3,27 ± 0,533,22 ± 0,393,29 ± 0,332,98 ± 0,17
Нирковий коефіцієнт0,63 ± 0,070,62 ± 0,060,56 ± 0,06 ∗ 0,55 ± 0,04
Глюкоза в крові (ммоль/л)6,24 ± 0,526,24 ± 0,696,56 ± 0,585,57 ± 0,34 #
Тригліцериди (ммоль/л)0,93 ± 0,370,74 ± 0,071,22 ± 0,220,92 ± 0,24 #
Загальний холестерин (ммоль/л)1,63 ± 0,161,59 ± 0,351,99 ± 0,26 ∗ 1,49 ± 0,14 #
HDL-C (ммоль/л)1,34 ± 0,281,30 ± 0,190,84 ± 0,26 ∗ 1,43 ± 0,14 #
LDL-C (ммоль/л)0,29 ± 0,120,13 ± 0,08 ∗ 0,68 ± 0,11 ∗ 0,23 ± 0,12 #

3.2. Вплив GTP на IPGTT та ITT щурів

Резистентність до інсуліну тісно пов’язана з хронічною хворобою нирок (ХХН), і рівень інсуліну може порушити кетогенну активність. Таким чином, ми виміряли чутливість та сироваткову концентрацію інсуліну. Площа під кривою IPGTT була більшою у групі HFD, ніж у групі транспортних засобів (P 1 (a) та 1 (b)). Крім того, після внутрішньочеревної ін’єкції інсуліну рівень глюкози в сироватці крові через 30 та 60 хвилин був набагато вищим у групі HFD, ніж у групі CON (Рисунок 1 (c)). HFD збільшив концентрацію інсуліну в сироватці крові, яка, як видається, знизилася при лікуванні ГТФ, хоча різниця не була статистично значущою (Рисунок 1 (d)).