Не спостерігається впливу метформіну на вроджену гіперреактивність дихальних шляхів та посилення реакції на озон у мишей із ожирінням

Анотація

ожиріння є фактором ризику розвитку астми. Багаторазові дослідження поперечного перерізу серед великих груп дорослих та дітей з різним етнічним походженням вказують на те, що поширеність астми вища серед осіб із ожирінням та надмірною вагою. Крім того, кілька великих проспективних досліджень показують, що ожиріння спричиняє астму (див. Останні огляди в посиланнях 16, 61 та 63). Пацієнти з астмою з ожирінням, які втрачають вагу, відчувають менше симптомів астми, збільшують швидкість потоку повітря, зменшують пікову варіабельність потоку та покращують контроль астми (21, 43, 68). Ожиріння також впливає на контроль астми та ефективність деяких препаратів від астми (13, 36, 51, 55).

вроджену

Бігуанід метформін - це пероральний інсуліносенсибілізуючий засіб, який зазвичай використовується при лікуванні діабету 2 типу. Лікування метформіном також покращує діабетичний фенотип ожиріних мишей, зменшуючи рівень глюкози натще і послаблюючи експресію глюконеогенних ферментів у печінці (7, 17, 18, 23, 39, 70). У людей, що отримують метформін, також послаблюються аспекти системного запалення, пов’язаного з ожирінням (4, 10–12, 20). Метою цього дослідження було визначити, чи сприяє гіперглікемія легеневому фенотипу мишей із ожирінням. Відповідно, ми лікували худих диких та ожиріння дб/дб мишей перорально або водою, або метформіном щодня протягом 2 тижнів. Було використано дві когорти мишей, оброблених метформіном та водою. В одній когорті реакцію дихальних шляхів оцінювали через 24 години після останнього лікування, щоб визначити, чи може метформін послабити вроджену AHR дб/дб мишей. В іншій когорті, 24 після останньої обробки метформіном або водою, мишей піддавали гострому впливу О3 [2 частини на мільйон (проміле) протягом 3 год] і досліджували подальшу запальну реакцію.

Тварини.

Це дослідження було схвалено Постійним комітетом з тварин Гарвардського медичного округу. Повна жінка дб/дб і об/об мишей купували в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, штат Мексика). Оскільки ці миші знаходились на тлі C57BL/6J, мишами C57BL/6J з диким типом та віком відповідали як контролі. Обидва типи мишей є гіперфагічними, гіпометаболічними, гіперінсулінемічними, гіперглікемічними та масово ожиріними (37). Для підтвердження ефективності лікування метформіном щодо сироваткової глюкози ми використовували обидва об/об і дб/дб мишей. Для всіх інших експериментів ми використовували дб/дб лише миші.

Протокол.

Повним і худорлявим мишам вводили або воду, або метформін (300 мкг/г), щодня проводячи зонд протягом 2 тижнів. Інші повідомляють про зниження рівня глюкози в крові натще дб/дб миші з подібним протоколом лікування (17, 18). Було використано три когорти. В одній когорті, після останньої обробки, об/об і дб/дб мишей голодували протягом ночі для вимірювання глюкози в крові натще, використовуючи глюкометр Prestige Smart System IQ (Home Diagnostics, Форт-Лодердейл, Флорида) (4 миші, оброблені метформіном та 4). У другій когорті, через 24 години після останньої обробки, мишей знеболювали для вимірювання реакції дихальних шляхів з подальшим забором сироватки для оцінки системного запалення (n = 6–8 мишей на групу). Зверніть увагу, що нам не вдалося провести катетеризацію вени для доставки метахоліну в однієї миші, але ми все-таки зібрали зразок крові шляхом серцевої пункції у цієї миші. В останній когорті мишей піддавали дії О3 (2 ppm протягом 3 год) через 24 години після останньої обробки соновим втручанням. Через чотири години після впливу мишей евтаназували та провели бронхоальвеолярний лаваж (BAL) (n = 5–6 мишей/група).

Експозиція O3.

Пробуджених мишей без обмежень поміщали в окремі клітини з дротяної сітки всередину камери експонування з нержавіючої сталі та оргскла і піддавали впливу O3 (2 ppm протягом 3 годин), як описано раніше (29, 66). Протокол експозиції O3 був обраний для порівняння з даними інших дослідників, які вивчали гостре запалення, викликане O3, у мишей (5, 6, 25, 27, 49, 56, 72), в т.ч. дб/дб миші (41). Ця концентрація вища, ніж типова концентрація, яка використовується для впливу на людину. Однак інгаляційна доза O3 є продуктом не лише концентрації озону та часу впливу, але й хвилинної вентиляції (75). Вплив на людину, як правило, проводиться із суб’єктами, які займаються фізичними вправами, щоб збільшити хвилину вентиляції. На відміну від цього, миші зазнають глибокого зниження метаболізму під впливом O3, а при 2 ppm O3 їх хвилинна вентиляція зменшується до значень лише на третину від вимірюваних до впливу (64). Отже, хоча концентрації, що використовуються для досліджень на людях та мишах, можуть суттєво відрізнятися, фактична доза вдиху озону, швидше за все, набагато порівнянніша.

Легенева механіка.

Не експонованих мишей знеболювали ксилазином (7 мг/кг) та пентобарбіталом натрію (50 мг/кг). Трахею канюлювали за допомогою трубного адаптера, а хвостову вену канюлювали для доставки ацетил-β-метилхоліну хлориду (метахолін; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі). Мишей провітрювали за допомогою спеціалізованого вентилятора (flexiVent; SCIREQ, Монреаль, КК, Канада). Частота була встановлена ​​на рівні 150 Гц та 180 Гц для дикого типу та дб/дб мишей, відповідно. Дещо вища частота, що використовується для дб/дб мишей було обрано тому, що ці миші дихають спонтанно з більшою частотою, але з приблизно таким самим дихальним об'ємом, як миші дикого типу (41). Отже, дихальний об'єм встановлено на рівні 0,3 мл для обох штамів. З кожного боку грудної стінки було зроблено велике вікно, відрізавши частину деяких ребер і тканини між ними. Таким чином, легені в основному піддавалися атмосферному тиску, і зроблені вимірювання зменшували будь-який внесок грудної стінки в легеневу механіку. Позитивний тиск на кінці видиху 3 смH2O застосовували, помістивши лінію видиху під воду.

Ми та інші повідомляли, що реальні та уявні частини ZL як функція частоти добре відповідають цій моделі в цьому діапазоні частот (24, 53, 54).

Бронхоальвеолярний промивання.

Через чотири години після припинення впливу О3 мишей евтаназували передозуванням пентобарбіталу натрію. Трахею канюлювали і легені двічі промивали 1 мл PBS/0,6 мМ EDTA. BAL центрифугували, а загальну кількість клітин і диференціалів BAL оцінювали, як описано раніше (28–30, 32). Супернатант BAL заморожували при -80 ° C, а потім аналізували на наявність хемокінів, отриманих кератиноцитами (KC), запального білка 2 макрофагів (MIP-2), індукованого інтерфероном білка 10 (IP-10), індукованого LPS хемокіну CXC (LIX) ) та білок хемоаттрактантів моноцитів 1 (MCP-1), використовуючи набори імуноферментного аналізу DuoSet (ELISA) (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота). Ці хемотаксичні фактори нейтрофілів були обрані тому, що вони характерні для гострого впливу О3 та тому, що, як повідомляється, вони сприяють припливу нейтрофілів, який супроводжує гостре окислення О3 у мишей (14, 29, 32, 33, 41, 45, 66, 71 ). Важливо, що за наявності гіперглікемії інші гострі запальні подразники також призводять до більшої індукції багатьох з цих хемокінів (19).

Маркери системного запалення.

Зразки крові отримували шляхом серцевої пункції, виділяли сироватку і зберігали при -20 ° C до аналізу методом ІФА на MCP-1, лептин та адипонектин (R&D Systems). Оскільки вплив O3 як таке може змінити ці фактори, аналізи проводили лише на сироватці мишей, що використовувалась у механічних дослідженнях.

Статистичний аналіз.

Відмінності у масі тіла, RL, Raw, G, H, Параметри BAL та сироваткові маркери запалення оцінювали за допомогою факторіального ANOVA, використовуючи генотип та медикаментозне лікування як основні ефекти. У кожному випадку для порівняння post hoc використовували тест на найменшу значущу різницю. Порівняння рівня глюкози в сироватці крові проводили неспарені дослідження Стьюдента т-тести. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SAS (SAS Institute, Cary, NC). Усі результати представлені як середні значення ± SE, якщо не вказано інше. P

Таблиця 1. Вимірювання загальної механіки легеневих, дихальних шляхів та паренхіми у ожиріних db/db і худих мишей дикого типу, оброблених водою або метформіном

Значення є середніми ± SE. Вимірювання проводили через 24 години після останньої обробки сонометра. RL, резистентність легенів; Сирий, опір дихальних шляхів; G, коефіцієнт затухання легеневої тканини; H, коефіцієнт еластичності легеневої тканини.

* P жиру миші та миші з ожирінням, спричиненим дієтою, також є результатом посилення дихальних шляхів, а не реакцій тканин (31, 32, 66).

Рис. 1.Зміни загального легеневого опору (RL) (A), опір дихальних шляхів (Raw) (B), а також коефіцієнт затухання легеневої тканини (G) (C.), індукований внутрішньовенним введенням метахоліну у дикому типі (WT) та дб/дб мишей. Мишей обробляли промиванням водою або метформіном один раз на день протягом 2 тижнів. Вимірювання проводили через 24 години після останньої обробки. Результати є середніми ± SE даних 6–7 мишей у кожній групі. *P

Метформін не впливав на метахолінові зміни в легеневій механіці дб/дб або мишей дикого типу. Факторна ANOVA вказувала на значні ефекти генотипу (P

Рис.2.Бронхоальвеолярні промивні нейтрофіли (A), хемокіни, отримані з кератиноцитів (KC) (B), макрофагальний запальний білок 2 (MIP-2) (C.), Індукований LPS хемокін C-X-C (LIX) (D), індукований інтерфероном білок 10 (IP-10) (Е), і моноцитарний хемоаттрактантний білок 1 (MCP-1) (F) в WT та дб/дб миші, що зазнали впливу О3 (2 частини на мільйон протягом 3 год). Мишей досліджували через 4 год після припинення впливу О3 і обробляли зондом або водою, або метформіном щодня протягом 2 тижнів перед експозицією. Результати є середніми ± SE даних 5–6 мишей на групу. *P

Ми також виміряли концентрацію BAL хемокінів, які індукуються O3 та мають хемотаксичну активність щодо нейтрофілів (рис. 2). Показано, що гіперглікемія впливає на індукцію багатьох з цих хемокінів, що виникає у відповідь на інші запальні подразники (19, 40). Факторна ANOVA вказувала на значний вплив штаму на BAL MIP-2, KC, MCP-1, LIX та IP-10 (P

Рис.3.Сироватка MCP-1 (A), лептин (B) і адипонектин (C.) у неекспонованих WT та дб/дб мишей, оброблених метформіном або водою щодня протягом 2 тижнів. Результати є середніми ± SE даних для 6–8 мишей на групу. *P

Наші дані вказують на те, що 2 тижні щоденного лікування метформіном послаблює гіперглікемію у мишей із ожирінням, не змінюючи ні їх вроджену AHR, ні підвищену легеневу запальну реакцію на O3. Дані вказують на те, що фенотип легенів цих мишей з ожирінням, ймовірно, не пов’язаний з їх гіперглікемією.

Щоб оцінити потенційну роль гіперглікемії, ми лікували дб/дб миші з антигіперглікемічним агентом метформін. Метформін спричиняв помітне зниження рівня глюкози в крові натще, що узгоджується з попередніми дослідженнями на ожирених мишах, які отримували подібний спосіб (17, 18, 70). Метформін також знижував вміст глюкози в сироватці не натощак дб/дб мишей, хоча глюкоза залишалася набагато вище значень дикого типу. Здатність метформіну зменшувати рівень глюкози в крові походить від його здатності збільшувати засвоєння глюкози в скелетних м’язах (47) та зменшувати печінковий глюконеогенез (69). Ці дії, як видається, опосередковуються через зміни чутливості до інсуліну (7), викликані активацією АМФ-активованої протеїнкінази (AMPK), клітинного датчика енергетичного стану (76).

Відповідно до попередніх звітів (41), ми спостерігали більшу реакцію дихальних шляхів на внутрішньовенне введення метахоліну у людей із ожирінням дб/дб проти мишей дикого типу (рис. 1). Однак, хоча метформін суттєво знижував гіперглікемію натще у цих мишей, він не змінював їх вроджену AHR (рис. 1). Результати дозволяють припустити, що деякі аспекти фенотипу цих мишей із ожирінням, крім гіперглікемії, пояснюють їх рівень AHR, хоча можна подумати, що навіть помірне підвищення рівня глюкози в крові, таке, що залишилося натощак дб/дб миші, які отримували метформін, можуть сприяти AHR.

Таким чином, наші дані вказують на це 1) вроджений AHR та 2) у мишей із ожирінням спостерігається посилений приплив нейтрофілів, індукований O3, та експресія хемокінів. Ці відмінності, пов’язані з ожирінням, не зменшувались лікуванням метформіном, незважаючи на зменшення рівня глюкози в крові натще, що свідчить про те, що гіперглікемія навряд чи враховує легеневий фенотип цих мишей із ожирінням.

Це дослідження було підтримано Національним інститутом наук про здоров'я навколишнього середовища ES-013307 та ES-00002, Національним інститутом серця, легенів та крові HL-084044 та HL-33009, а також щедрим подарунком від Пола та Мері Фіннеган.