Наслідування людини танатомікробіом і час після смерті

Предмети

Анотація

Вступ

Дослідження метагеномного секвенування проекту Human Microbiome Project (HMP) характеризували складність людського мікробіома на численних ділянках тіла, підкреслюючи значні відмінності між мікробними спільнотами всередині та між особами 1. У здорової дорослої людини співвідношення 10: 1 клітин в організмі становить мікробні 1,2. Відправник та ін. 3 оскаржили цю оцінку і припустили, що співвідношення набагато ближче до 1: 1. Танатомікробіом - це посмертна мікробна спільнота людського тіла, яка включає послідовний процес, коли трильйони мікробів мешкають, розмножуються та гинуть внутрішньо та зовні по всьому мертвому тілу, що призводить до тимчасових зрушень у складі спільноти з часом 4,5. Після смерті середовище господаря змінюється внаслідок розкладання клітин і подальшого виходу клітинних компонентів в навколишні тканини. Існує кілька послідовних подій, які трапляються після смерті людини, що призводить до нестримного розмноження певних типів мікробних клітин та спокою або загибелі інших клітин 6,7,8,9,10 .

На вивчення танатомікробіому внутрішніх органів та крові безпосередньо не впливають ті самі абіотичні фактори навколишнього середовища (тобто рН та температура) та біотичні фактори (тобто діяльність комах та поглинача) 11, з якими стикається некробіом 12. Крім того, передбачається, що на танатомікробіом певних органів не впливають негайно мікроорганізми, пов’язані з кишечником, які швидко розмножуються після смерті людини 13. Колись давно існувало переконання, що внутрішні органи людини стерильні у живих господарів 14,15. Однак є достатньо доказів, продемонстрованих даними HMP, що деякі внутрішні органи (тобто легені та кишечник) забезпечують окремі ніші для коменсальних умовно-патогенних та патогенних мікроорганізмів для колонізації мікробіомів 1. Мікроби, виявлені у внутрішніх органах трупів, можуть представляти тих, які безпосередньо пов'язані з розкладанням людини. Туомісто та ін. 13 показали, що внутрішні органи, такі як печінка, залишаються стерильними до п'яти днів після смерті.

У міру розпаду людського тіла мікроби розмножуються в крові, печінці, селезінці, серці та мозку залежно від часу; тому відносна кількість мікробів буде змінюватися залежно від органу тіла та інтервалу після смерті (PMI) 5. Для того, щоб усунути недолік знань щодо внутрішнього танатомікробіома, ми описуємо тут результати найбільшого на сьогодні дослідження посмертних мікробних спільнот внутрішніх органів. Ми припустили, що в міру розкладання людського організму танатомікробіом у внутрішніх органах змінюється у структурі мікробної спільноти з плином часу. Щоб оцінити цю гіпотезу, ми відібрали 27 трупів із різним часом смерті (від 3,5 до 240 годин) за різними причинами смерті, використовуючи технологію секвенування ампліконів 16S рРНК для класифікації мікробних таксонів, пов’язаних з трупами. Крім того, ми продемонстрували значну кореляцію між сигнатурами танатомікробіомів, що відповідало PMI. Таким чином, ми підготували мікробний каталог танатомікробіому, який може створити корисний криміналістичний інструмент і надати конструктивну інформацію тим, хто вивчає останки людини.

Результати

Для дослідження танатомікробіомічних профілів, сформованих секвенированием амплікону гена 16S рРНК, ми відібрали та проаналізували внутрішні органи (мозок, серце, печінка та селезінка), щічні порожнини та/або кров 27 людських трупів із фактичних кримінальних справ з інтервалами після смерті від 3,5 Було зібрано 240 годин (таблиця S1). Загалом ми секвенували мікробну ДНК для 66 зразків з 27 трупів. Криві розрідження продемонстрували, що коли кількість зчитувань послідовностей зростала, багатство видів значно зростало з кожною пробою (рис. S1). Альфа-різноманітність, продемонстрована на кривих розрідження, показала, що тканини були достатньо послідовними, щоб спостерігати всі таксони. Більшість зразків досягли асимптоти, що свідчить про адекватні показники для порівняння зразків.

Окремі оперативні таксономічні одиниці (ОТУ) досліджували на предмет статистичної значущості та визначали відносну чисельність 20 найбільш переважаючих родів у всіх зразках (рис. 1). Результати показали, що роди бактерій були подібними між різними органами кожної статі, але були різними між самками та самцями. Винятком з цієї тенденції є щічна порожнина, для якої подібні роди спостерігались для обох статей, як показано на рис. 1. За винятком трьох зразків рота, решта зразків утворюють чітке скупчення в тепловій карті. Зважений UniFrac ADONIS на зразках ротової порожнини привів до дуже незначної різниці між статями (p = 0,923). Відносний вміст мікробів у зразках крові був подібним у кожному зразку з плином часу (рис. 1). ANOVA, вивчаючи відмінності у різноманітності Шеннона, з'ясував значні відмінності між усіма типами органів (p Таблиця 1 Результати ADONIS на основі незважених та зважених відстаней UniFrac.

спадкоємність

Відносна чисельність 20 найбільш переважаючих родів у всіх зразках.

На рис. 2 показані ділянки тіла зі значно різними значеннями α-різноманітності між самками та самцями. Були значні відмінності між жінками та чоловіками (p Рисунок 2

Відносна чисельність найбільш переважаючих бактерій між самками та самцями зразків.

Теплова карта була створена для візуалізації відносної чисельності 30 найбільш переважаючих родів бактерій (рис. 3). Зразки та роди бактерій були відсортовані відповідно до евклідових метрик та незважених відстаней UniFrac, відповідно. Теплова карта показала подібні взаємозв'язки; щічна порожнина містила подібні організми (напр., Стрептококи, вієлонели та превотелли), причому всі інші типи органів мають більш подібне співтовариство між собою, ніж щічна порожнина.

Теплова карта для візуалізації відносної чисельності 30 найбільш переважаючих родів бактерій.

Роди бактерій та зразки були відсортовані на основі евклідової та незваженої відстані UniFrac, відповідно.

Міри мікробної різноманітності перевіряли на відмінності за допомогою тесту ADONIS на основі відстаней UniFrac (табл. 2). Значущі відмінності (p Таблиця 2 Результати ANOVA, тестування на відмінності в багатстві Chao1 та різноманітності Шеннона серед груп.

Аналіз основних координат (PCoA) на основі незважених та зважених відстаней Unifrac був визначений для всіх зразків (рис. 4). PCoA, заснований на незважених відстанях UniFrac, показав, що зразки щічної порожнини утворювали відмінну групу від інших типів зразків (рис. 4а). PCoA для жіночих зразків з високим PMI збігався близько 0 для обох осей, як показано на рис. 4b. Як видно з незважених відстаней UniFrac PCoA, на зваженому PCoA була зображена така сама окрема група щічної порожнини (рис. 4в). Для зваженої відстані PCoA на відстані UniFrac з проілюстрованим PMI зразки з високим PMI розташовувались в одній області приблизно (0,1, -0,1). Знову ж таки, це були всі жіночі зразки, які мали високий ІМТ (рис. 4г).

(а) Аналіз основних координат (PCoA) бета-різноманітності на основі незважених відстаней Unifrac. (b) PCoA на основі незважених відстаней Unifrac з проілюстрованим PMI. (в) PCoA на основі зважених відстаней Unifrac та (d) зважені відстані Unifrac із проілюстрованим PMI.

Був проведений аналіз для визначення кореляції між сімействами, родами чи видами PMI за допомогою випадкового лісового аналізу (рис. 5, таблиця S2) 15,16,17,18. Результати визначили список таксонів-кандидатів, які з часом змінювались в достатку за статтю та типом вибірки (Таблиця S2). Ці аналізи демонструють невідоме Clostridium sp. (Рис. 5а), Clostridium novi (Рис. 5b), Prevotella bivia (Рис. 5в) та Prevotella timonensis (Рис. 5г). Для обох родів існували різні види, які зростали в достатку на початку розкладання, які відрізнялися від родів, які домінували при більш тривалих ІМП. Цікаво, що кілька родів, таких як Клострідій і Превотелла, володів різними видами, які потенційно могли передбачати різні періоди розкладання. Наприклад, C. novyi була відносно більш рясною на останніх ІМВ; ще невідомий Клострідій вид був більш поширеним раніше при розкладанні.

Такса ідентифікував на основі випадкового аналізу лісів кореляцію між PMI та OUT.

Кожен орган представлений різним кольором: червоний = мозок, зелений = серце, синій = печінка, чорний = кров, блакитний = рот, рожевий = селезінка. Вісь X - це PMI в годинах, а вісь Y представляє відсоток зчитування послідовностей, віднесених до цього виду у зразку. Результати представлені для (a) Clostridium novi, (b) невідомий Клострідій, (c) Prevotella bivia і (d) Prevotella timonensis.

Ідентичність найбільш поширеної філи також була визначена, щоб показати суттєво різну кількість речовин між органами (рис. 6). Дивно, але Firmicutes (що включає Клострідій) вказаний у всіх порівняннях, що означає, що це, ймовірно, стабільний біомаркер у спільнотах танатомікробіомів, що походять з різних місць в організмі. Зразки зі значеннями p Рисунок 6

Результати порівнянь для виявлення філи зі значно різною кількістю між зразками трупа.

Обговорення

У цьому дослідженні ми описуємо, як ми склали найповніше на сьогодні обстеження на основі ампліконів для оцінки людського танатомікробіому фактичних трупів за кримінальною справою. Незважаючи на велику кількість мікробних розкладачів у трупах, існує дефіцит конкретних мікроорганізмів, що беруть участь у розпаді внутрішніх органів людини. У здорових людей більшість внутрішніх органів вважаються стерильними або в основному позбавлені мікроорганізмів завдяки постійному нагляду з боку імунної системи 14,19. Після смерті імунна система вже не функціонує, а розмноженню мікробів сприяє багате на поживні речовини середовище трупа 5,11,17,18,20 .

Розкладання людини пояснюється насамперед бактеріями; однак огляд наукової літератури демонструє відсутність всебічних емпіричних знань про ідентичність бактерій, що розмножуються у внутрішніх органах людини після смерті. Наприклад, Can та ін. 5 проведено мікробне обстеження танатомікробіому, асоційованого з тканинами внутрішніх органів одинадцяти трупів, з використанням незалежних від культури методів піросеквенування Roche 454. Результати дослідження показали, що облігатний анаероб, Клострідій, був знайдений у трупах різного періоду смерті, в той час як факультативний анаероб, Лактобактерії, було більше в трупах з меншими інтервалами після смерті (тобто 29,5 годин проти 240 годин) 5. На думку Гайда та ін. (2013 і 2015 рр.) У дослідницькому аналізі бактерій, що знаходяться в щічній порожнині, та ректальному зіскрібку трупів, що розкладаються в природних умовах, було продемонстровано, що в межах місця відбору зразків трупа існувала різниця між початком та кінцевими точками етапу здуття 21, 22 .

Цікавою знахідкою цього дослідження є поява а Pseudomonas sp. виявляється виключно в жіночих трупах проти а Rothia sp. знайдено в чоловічому трупі. Псевдомонада є аеробною грамнегативною паличкою, яка викликає серйозні опортуністичні інфекції у людей.

Кілька цікавих особливостей було виявлено під час випадкового аналізу лісів (рис. 5, таблиця S2). По-перше, із збільшенням глибини таксономічного рівня в аналізі (переходячи від королівства до виду), пояснювалась і відхилена інформація, про яку повідомляється. Аналіз сімейного та родового рівнів пояснив приблизно 21% дисперсії в моделях, що співвідносять ІМТ із змінними, що цікавлять, а аналіз рівня видів пояснив 65% (таблиця S2). По-друге, внутрішній орган постійно входив до числа 14 найважливіших факторів моделей, а стать - до 38 найкращих.

Створення каталогу дискретних мікробіологічних факторів, що регулюють структурні та динамічні зміни людського танатомікробіома, є важливим для з'ясування того, як відбувається гниття людини. Інші дослідницькі зусилля застосовували подібні підходи до опитування мікробіоти гниття за допомогою сурогатів людини, таких як миші та свині 12,16,18, і встановили, що чисельність певних бактерій (наприклад, Firmicutes) у певні моменти часу під час розпаду свідчить про час смерті. Наприклад, у Metcalf та ін. (2014), “микробний годинник” був продемонстрований на моделі миші, і оцінки PMI підтвердили фактичні PMI приблизно протягом трьох днів 16. Аналогічним чином результати нашого дослідження показали Firmicutes як потенційний біомаркер у спільнотах танатомікробіомів.

Однією з особливо важливих сфер для оцінки є той факт, що це дослідження не визначило вплив температури навколишнього середовища як суттєвий фактор, що сприяє різниці в структурі громади. Може бути помилка у визначенні цих температурних впливів, оскільки трупи були знайдені в різних місцях при різних температурах 23. Крім того, організм може достатньо ізолювати внутрішні органи від температурних змін, щоб інші фактори (наприклад, стать) могли надавати більший вплив на спільноту.

У поточному дослідженні представлений потенціал нового підходу до визначення часу смерті за допомогою експертних знань із судово-медичної генетики, секвенування ДНК та біоінформатики. На сьогоднішній день наше дослідження представляє найбільший каталог мікробного різноманіття внутрішніх компонентів танатомікробіому людини. Крім того, це дослідження показало нову інформацію про те, як мікробні популяції змінюються в різних внутрішніх зразках за часом, коли людина гине, що на сьогоднішній день недостатньо усталене. Визначення часу у вузькому вікні є надзвичайно важливим у розслідуванні кримінальних справ і узгоджується із завданням медичного права щодо надання об’єктивних, обґрунтованих доказів знань та інструментів для вирішення проблем судово-генетичної експертизи. Ця інформація також корисна патологоанатомам та іншим дослідникам, які працюють з розкладаються рештками людей та тварин, оскільки вона надає інформацію про ідентичність, місцезнаходження та часові рамки колонізації мікроорганізмів, з якими можна зіткнутися після смерті. Майбутні напрямки включатимуть дослідження для пояснення виникнення Ротія, грампозитивні кокко-бацили, що викликають різноманітні серйозні інфекції, виявлений у чоловічому випадку, який помер від випадкової передозування наркотиками.

Проект посмертного мікробіома людини (HPMP)

Проект посмертного мікробіома людини (HPMP) намагається обробляти дані, що представляють великий ресурс, що каталогізує велику кількість та різноманітність мікроорганізмів, що беруть участь у розкладанні людини (та/або сурогатів людини) 4. Роль робочої групи полягає у забезпеченні основи для внутрішніх (танатомікробіом) та зовнішніх (некробіом та могильна ґрунт) мікробних спільнот. Основною метою HPMP є поліпшення розуміння та практичних застосувань, що стосуються вирішення питань, що стосуються способу оцінки смерті та інтервалу після смерті. Далі, цей проект сприятиме узгодженим зусиллям щодо перевірки та стандартизації протоколів для встановлення основи для використання в судових розслідуваннях.

Методи

Трупні випадки та збір зразків

Екстракція ДНК Thanatomicrobiome, ампліфікація ПЛР та аналіз даних MiSeq

Потім дані послідовностей аналізували в науково-дослідній лабораторії, використовуючи стандартний конвеєр для аналізу мікробного різноманіття, що складається з двох основних стадій, стадії виявлення шуму та химери та стадії аналізу мікробної різноманітності. На етапі виявлення шуму та виявлення химери проводили шумозаглушення, використовуючи різні техніки для видалення коротких послідовностей, одиночних послідовностей та шумних читань. Далі було проведено виявлення химери для видалення химерних послідовностей. Нарешті, решту послідовностей потім коригували базово-базово для видалення шуму зсередини кожної послідовності. На етапі аналізу різноманітності кожна проба проходила через аналітичний конвеєр, щоб згрупувати зчитування в OTU, які потім пройшли таксономічну класифікацію для виявлення видового рівня.

Біостатистичний аналіз даних

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Яван, Г. Т. та ін. Наслідування людини танатомікробіом і час після смерті. Наук. Респ. 6, 29598; doi: 10.1038/srep29598 (2016).