Модель миші для гематогенної дисемінованої інфекції Candida glabrata, починаючи з кишечника: оцінка штамів з різними адгезійними властивостями

Раліца Атанасова

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

Адела Ангулвант

2 AP-HP, Hôpital Bicêtre, Unité de Parasitologie-Mycologie, Le Kremlin-Bicêtre, Франція,

3 Université Paris-Sud 11, Institut de Génétique et Microbiologie та CNRS UMR 8621, Орсе, Франція,

Морел Тефіт

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

Фредерік Гей

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

4 APHP, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Service de Parasitologie-Mycologie, Париж, Франція,

Джульєтта Гітар

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

5 INSERM, U945, Париж, Франція,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Service de Parasitologie-Mycologie, Париж, Франція,

Домінік Мазьє

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

5 INSERM, U945, Париж, Франція,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Service de Parasitologie-Mycologie, Париж, Франція,

Сесіль Фейрхед

3 Université Paris-Sud 11, Institut de Génétique et Microbiologie та CNRS UMR 8621, Орсе, Франція,

Крістоф Хеннекін

1 Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж6, UMR S945, Париж, Франція,

5 INSERM, U945, Париж, Франція,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Service de Parasitologie-Mycologie, Париж, Франція,

Задумав і спроектував експерименти: DM CF CH. Виконував експерименти: РА АА МТ. Проаналізовано дані: FG JG. Написав папір: RA CF CH.

Пов’язані дані

Анотація

Адгезія до слизової травної системи вважається вирішальним першим кроком у патогенності інвазивних інфекцій Candida. Дисеміновані інфекції Candida glabrata переважно починаються з кишечника. Була створена модель миші дисемінованої інфекції, починаючи з кишечника. Гематогенне розповсюдження було отримано після дієти з низьким вмістом білка з подальшим режимом циклофосфамід-метотрексату та пероральним посівом дріжджів через питну воду. Печінка була першим інфікованим органом (день 7 після зараження), а летальність становила 100% на день 21 після зараження. Ця нова модель миші була використана для порівняння рівня смертності та грибкового навантаження в глибоких органах, викликаних 5 штамами, що виявляють різні рівні адгезії до клітин ентероцитів Caco-2, як було визначено в тесті на 36 штамах C. glabrata. У цій моделі не було продемонстровано статистичної різниці летальності між штамами, а грибкове навантаження варіювало в нирках і легенях, але без кореляції з рівнем адгезії до ентероцитів. Подальші дослідження з використанням розробленої тут моделі дозволяють проаналізувати схрещування дріжджів слизової оболонки травлення та допоможуть пов’язати це з ще недостатньо вивченими адгезійними фенотипами.

Вступ

Інвазивні кандидози - це загрожуючі життю опортуністичні інфекції, кількість яких різко зросла протягом 1980-х [1]. Хоча Candida albicans залишається основною причиною цих інфекцій, Candida glabrata значно виникла і зараз регулярно посідає друге місце серед етіологічних агентів різних клінічних форм кандидозів [2], [3]. C. glabrata представляє серйозну терапевтичну проблему завдяки своїй природній стійкості до похідних азолу і, можливо, через затримку відповідного початку терапії, деякі повідомлення описують вищі показники смертності від інфекцій C. glabrata, ніж від C. albicans [4].

Таким чином, у цій роботі ми спершу хотіли створити мишачу модель дисемінованої інфекції C. glabrata, починаючи з кишечника, яка може бути використана в подальшому для аналізу механізмів, схильних до перетину шлунково-кишкового бар'єру шлунком через C. glabrata . Після валідації ця модель була використана для боротьби з мишами з клінічними штамами, що належать до того самого клонального комплексу, і раніше характеризувались як низьким, так і високим рівнем адгезії, як тестували на клітинній лінії ентероцитів Caco-2.

Матеріали і методи

Штами

У цьому дослідженні була використана панель із 36 клінічних штамів C. glabrata та еталонного штаму ATCC2001 (CBS138). Класифікація їх генотипів та клональних груп раніше була визначена за допомогою молекулярного методу, заснованого на аналізі поліморфізму довжини мікросупутникових областей [13], [14]. Тип спарювання кожного з цих штамів також раніше визначали за допомогою комбінації конкретних праймерів. Для цього дослідження штами були відібрані таким чином, щоб у кращому випадку представляти генотипове різноманіття виду (тобто належність до різних клональних комплексів з вищезазначених досліджень). Моноклональну субкультуру кожного штаму зберігали при -80 ° C. Для експериментів вихідні культури висівали на 1% дріжджовий екстракт 1% пептон-2% глюкози (YPD), а потім інкубували при 37 ° C протягом 24 годин.

Мишача модель гематогенного дисемінованого кандидозу

Дослідження проводилось відповідно до європейського законодавства, що стосується використання тварин у наукових цілях. Протокол був схвалений місцевим інституційним комітетом з догляду та використання тварин Факультету медицини Піті-Сальпетрієр.

Адгезія ентероцитів

Аналізи адгезії проводили за допомогою клітинної лінії Caco-2, отриманої з колоректальної карциноми [15]. Клітини вирощували на скляних кришках діаметром 11 мм, розміщених у 24-лунковому пластиковому посуді. Клітинам дозволяли диференціюватись у моношарах протягом 16–21 днів при 37 ° С з 5% СО2. Клітини промивали та інфікували 107 стаціонарними фазами росту клітин C. glabrata, суспендованих у 500 мкл попередньо нагрітого сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS). Після 30 хв інкубаційного періоду при температурі 37 ° C клітини обережно промивали три рази для видалення неприлиплих дріжджів. Потім клітини Caco-2 з прилепленими дріжджами зішкріб і збирають у 500 мкл PBS. Серійні розведення висівали на середовище YPD та інкубували протягом 48 годин при 37 ° С. Одиниці утворення колоній (КУО) підраховували і використовували для розрахунку швидкості адгезії як відношення КОЕ, поділене на кількість інокульованих клітин (10 7). Для того, щоб обмежити вплив мінливості варіабельності, швидкість адгезії даного штаму ділили на швидкість адгезії контрольного штаму ATCC2001, випробуваного в тому ж експерименті. Кожен ізолят тестували у двох примірниках та проводили два окремі експерименти (зібрано чотири набори даних).

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism проти 5.0 (програмне забезпечення GraphPad). Медіани повторних вимірювань адгезії до клітин Сако-2 порівнювали між штамами за допомогою тесту Крускала-Уолліса з подальшим пост-тестом Данна для кожної пари штамів. Подібним чином, порівняння між клональними комплексами та типом спаровування проводили за допомогою критерію суми рангу Крускала-Уолліса (кількісна шкала). Порівняння кривих виживання було виконано за допомогою тесту рангового рейтингу Мантел-Кокса. Грибкове навантаження на органи, визначене підрахунком КУО на г, аналізували за допомогою непараметричного тесту Манна-Уітні, коли порівнювали дві групи, та непараметричного тесту Крускала-Уолліса для більш ніж двох груп. Пари груп далі порівнювали з тестом Данна. Значення Р менше 0,05 вважалося значущим.

Результати

Розробка мишачої моделі гематогенного кандидозу з кишечником як відправною точкою

Для того, щоб імітувати в кращому випадку гематогенне розповсюдження C. glabrata, починаючи з кишечника, ми розробили модель миші з пероральним посівом дріжджів, використовуючи штам типу ATCC2001. До зараження мишей годували дієтою з низьким вмістом білка, сприятливим фактором, який раніше розріджував слизову оболонку тонкої кишки та товстої кишки, сприяючи колонізації Candida [16]. Нейтропенія була додатково індукована цитотоксичним режимом хіміотерапії.

гематогенної

П’ятитижневі самки мишей DBA2/J заражаються 5 × 10 7 КУО/мл у питній воді протягом п’яти днів після 14 днів дієти з низьким вмістом білка та голодування через 24 години. Протокол хіміотерапії, що включає одну ін'єкцію MTX ip та ін'єкцію CPA/день протягом п'яти днів поспіль, слідує за інфекцією. Мишей забезпечують стерильною водою, яка постачається енрофлоксацином від початку хіміотерапії до кінця експерименту. MTX: метотрексат, CPA: циклофосфамід.

Після жертвоприношення тварини з кожної групи в різні моменти часу після зараження органи асептично видаляли і гомогенізували за кількістю КУО (n = 3/день).