Катепсин В, що походить від клітин пухлини та макрофагів, сприяє прогресуванню та метастазуванню в легенях раку молочної залози

Анотація

катепсин В
макрофаги
миша
рак молочної залози
метастазування

Вступ

Крім того, підвищена експресія та протеолітична активність лізосомальних протеаз (наприклад, аспартилових протеаз катепсину D та цистеїнових протеаз CTSB та катепсину L) часто позитивно корелюють із поганим прогнозом для пацієнтів із різними злоякісними захворюваннями, включаючи аденокарциноми молочної залози (14-17 ). Більшість експериментальних доказів щодо участі лізосомальних протеїназ цистеїну в пухлинному процесі отримано з використанням моделей культури ex vivo (18–20). Нещодавно у дослідженні із застосуванням інгібітора широкого спектра дії катепсинів цистеїну в моделі миші Rip1-Tag2 було визначено роль цистеїнових катепсинів в ангіогенезі та зростанні пухлини та інвазивності в пухлинах панкреатичних острівців (21). Хоча ці дослідження чітко підтверджують важливість цього класу протеаз, вони не передбачають конкретної ролі CTSB у прогресуванні та метастазуванні раку in vivo.

Для вирішення ролі CTSB у зростанні та метастазуванні раку ми встановили модель раку молочної залози у мишей за відсутності CTSB шляхом схрещування дефіцитних CTSB мишей (22) із чутливим до раку молочної залози штамом мишей [антиген поліоми середнього Т (PyMT) миші], в яких експресія PyMT спрямована на епітелій молочної залози вірусом пухлини молочної залози миші (MMTV) - тривалим термінальним повторенням (23). Тут ми показуємо основний вплив CTSB на прогресування індукованих PyMT карцином молочної залози та формування метастазів у легенях. Крім того, висновки вказують на значний внесок CTSB з ракових клітин, а також з клітин мікросередовища пухлини у ріст експериментальних метастазів у легенях.

Матеріали і методи

Тварини. Щоб зменшити вплив генетичного фону як змінну в експерименті, мишей з дефіцитом CTSB (22) протягом семи поколінь рекровзували до трансгенного штаму миші FVB/N-TgN (MMTVPyVT) 634Mul (PyMT; посилання 23), який було отримано з лабораторії Джексона (Бар-Харбор, Міссурі). Після інтеркросу пухлинні миші дикого типу, гетерозиготні та з дефіцитом CTSB були названі PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− та PyMT; ctsb -/- відповідно.

Дослідження прогресування пухлини. Починаючи з 30-денного віку, самок мишей тричі на тиждень обстежували на предмет розвитку пухлин молочної залози пальпацією пальців пальцями за сліпим генотипом способом. Після того, як пухлини були вперше виявлені, діаметри пухлин вимірювали штангенциркулями кожні 2 дні до 98 днів. Для дослідження прогресування пухлини у чоловіків мишей пальпували два рази на тиждень.

Гістоморфометрія. Для об'ємного вимірювання загальних легеневих метастазів або дисемінованих колоній пухлини в легенях криоембедовані легені розрізали поперечно до трахеї на систематичні випадкові плити товщиною 2 мм. 5–7 плит, отримані з кожного легені, вбудовували Tissue-Tek в один блок, як зазначено раніше (24). З кожного блоку отримували 5 мкм зрізи кріостату і фарбували H&E. Стереологічне визначення обсягів метастазів проводили за допомогою комп'ютерного підрахунку точок, як описано раніше (24).

Імуногістохімія та імунофлюоресценція. Козине антитіло проти щурів до CTSB (надане Е. Вебером, Університет Мартіна-Лютера, Галле, Німеччина; посилання 22) було використано для виявлення CTSB. Для імунофлюоресцентної мікроскопії з подвійною міткою CTSB-F4/80 антитіло до CTSB козла було візуалізовано анти-козячим антитілом Alexa Fluor 488 (Invitrogen Molecular Probes, Карлсруе, Німеччина). Після блокування козячим IgG антиген макрофага F4/80 був виявлений антитілом F4/80 щуря (Serotec, Дюссельдорф, Німеччина), а потім козячим анти-щурячим антитілом, позначеним Alexa Fluor 546 (Invitrogen Molecular Probes). Ядерне фарбування проводили за допомогою Hoechst 33342.

Виділення первинних клітин пухлини з інфікованих PyMT карцином молочної залози. Первинні пухлинні клітини PyMT отримували шляхом механічної та ферментативної дисоціації твердих індукованих PyMT карцином. Отриману суспензію послідовно переносили через 100 та 40 мкм клітинні сита, промивали двічі PBS і культивували протягом 12 годин. Імунодетекція за допомогою пан-цитокератинових антитіл (Sigma, Гамбург, Німеччина) виявила 98% цитокератин-позитивних пухлинних клітин через 12 годин у культурі. Життєво важливі та прикріплені клітини збирали методом трипсинізації, промивали PBS та негайно заморожували у середовищі, що містить 10% DMSO, для подальшого використання.

Аналіз колонізації легенів після в/в. ін'єкція LacZ-мічених клітин пухлини PyMT. Ізольовані первинні пухлинні клітини були генетично мічені ретровірусною трансдукцією бактеріального гена LacZ відповідно до інструкцій виробника (BioCarta, Ann Arbor, MI; посилання 25). Позначення LacZ було перевірено фарбуванням X-gal, і для аналізу використовували лише пули зі 100% ефективністю трансдукції. Через два дні після трансдукції 1 × 10 5 мічених LacZ мічених первинних пухлинних клітин генотипів PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/−, або PyMT; ctsb -/- (чотири миші-донори на генотип) вводили внутрішньовенно. у хвостові вени ctsb +/+, ctsb +/− та ctsb -/- вроджених мишей-реципієнтів (п’ять реципієнтів на донора). Через двадцять один день після інокуляції пухлинних клітин легені виділили і пофарбували X-gal, а кількість поверхневих колоній в легенях кількісно оцінили.

Аналіз клітинної інвазії in vitro. Вставки для культури клітин, запечатані мікропористою мембраною розміром у 8 мкм, заповненою Matrigel (BD Biosciences, Гейдельберг, Німеччина), використовувались для досліджень інвазії. Матригель сушили в ламінарному витяжці і відновлювали 500 мкл DMEM протягом 1 години при 37 ° С. Внутрішні відділи вставок клітинної культури заповнювали 5 × 10 4 клітинами PyMT в DMEM без FCS. Загальний інгібітор цистеїнового катепсину E64 додавали відразу після клітинного покриття (кінцева концентрація, 10 мкмоль/л), а нейтралізуюче антитіло до катепсину X (R&D Systems, Міннеаполіс, MN) при кінцевій концентрації 1 мкг/мл попередньо інкубували з клітинами протягом 15 хвилин при 37 ° С перед аналізом. Нижні відділення заповнювали 1 мл DMEM, що містить 10% FCS у якості хемоаттрактанта, і, де це застосовно, 10 мкмоль/л E64 або 1 мкг/мл нейтралізуючого антитіла до катепсину X. Через 20 годин при 37 ° C і 5% CO2 вставки видаляли, а клітини, прикріплені до зовнішньої сторони пористої мембрани, отримували шляхом трипсинізації та обережного вишкрібання. Життєво важливі клітини підраховували за допомогою лічильника клітин CASY (Schärfe Systems, Ройтлінген, Німеччина).

Аналіз імуномаркування катепсину X. Для імунодетекції катепсину X клітинної протеази мітили DCG-04, як описано вище, і очищали за допомогою магнітних гранул, ковалентно зчеплених зі стрептавідином (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal, Осло, Норвегія). Обложені поверхневі цистеїнові протеази розчиняли за допомогою 15% SDS-PAGE, переносили їх на мембрани PVDF і зондували антитілами до козячого анти-катепсину X (R&D Systems). Загальну експресію білка катепсину X визначали за допомогою вестерн-блоту загального клітинного лізату з антитілами до катепсину X та виявляли за допомогою посиленої реакції хемілюмінесценції (Pierce, Rockford, IL). Результати нормалізували до рівня β-актину.

Кількісна ПЛР в режимі реального часу. Загальну РНК виділяли з пухлин молочної залози PyMT за допомогою набору RNeasy (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія). Шаблони кДНК першого ланцюга були зворотно транскрибовані із загальної РНК 5 мкг (Invitrogen, Карлсруе, Німеччина). Формування продуктів ПЛР постійно вимірювали шляхом включення SYBR Green із системою виявлення ПЛР iCycler у режимі реального часу (лабораторії Bio-Rad), а відносна кількість мРНК CTSB, катепсину X та PyMT нормалізували до гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази. (GAPDH) стенограма. Генспецифічні праймери були такими: CTSB, 5′-TGCGTTCGGTGAGGACATAG-3 ′ (прямий) та 5′-CGGGCAGTTGGACCATTG-3 ′ (зворотний); катепсин X, 5′-TATGCCAGCGTCACCAGGAAC-3 ′ (вперед) і 5′-CCTCTTGATGTTGATTCGGTCTGC-3 ′ (реверс); GAPDH, 5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3 ′ (вперед) і 5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3 ′ (реверс); та PyMT, 5′-CTCCAACAGATACACCCGCACATACT-3 ′ (вперед) та 5′-GCTGGTCTTGGTCGCTTTCTGGATAC-3 ′ (реверс). Для кількісного визначення трансгену PyMT у колоніях пухлини легенів геномну ДНК виділяли з легенів мишей-реципієнтів клітин PyMT. ПЛР у реальному часі для кількісного визначення PyMT та GAPDH була такою, як описано вище.

Виявлення активності ферменту CTSB. Протеолітичну активність CTSB визначали у лізосомальних фракціях (10 мкг білка) у присутності флуорогенного субстрату Z-Phe-Arg-4-метил-кумарин-7-аміду (20 мкмоль/л; Bachem, Bubendorf, Швейцарія) та в наявність або відсутність CTSB-специфічного інгібітора CA074 (20 нмоль/л; Бахем). Виділення 7-аміно-4-метил-кумарину контролювали за допомогою спектрофлуорометрії при довжинах хвиль збудження та випромінювання 360 і 460 нм відповідно.

Статистичний аналіз. Порівняння середніх арифметичних показників між кількома групами аналізували за допомогою t-тесту (двосторонній) або ANOVA для експериментів з більш ніж двома підгрупами. Post hoc випробування на діапазон та парне багаторазове порівняння проводили за допомогою t-тесту (двосторонній). Пропорції порівнювали за допомогою тесту χ 2, а статистичний аналіз ділянок Каплана-Мейєра проводили за допомогою логарифмічного тесту. P ≤ 0,05 вважали статистично значущим. Статистичний аналіз метастазів у легені проводили шляхом аналізу коваріації (ANCOVA; Додаткові дані).

Результати

Придушення росту пухлини, викликаного PyMT, у самок мишей з дефіцитом CTSB. A, Каплан-Мейєр графіки для безпухлинного PyMT; ctsb +/+ (n = 18), PyMT; ctsb +/− (n = 20) та PyMT; ctsb -/- (n = 22) самок мишей. Перші пальпуються пухлини молочної залози були виявлені значно пізніше у PyMT; ctsb -/- самки мишей, ніж у PyMT; ctsb +/+ самки мишей (P +/− не показали суттєвої різниці до інших груп. B, детальна кінетика росту пухлини в PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− і PyMT; ctsb -/- самки мишей. Криві, середня кількість пухлин визначається з інтервалом у 2 дні відповідно до їх діаметра 1 см. Зірочки, статистично значущі відмінності в кількості пухлини між нокаутом CTSB та групами дикого типу трансгенних мишей PyMT, хоча PyMT; ctsb +/− миші-самки не виявляли суттєвої різниці до інших груп. *, P +/+, PyMT; ctsb +/− та PyMT; ctsb -/- групи відповідно. Частоти пухлин за їх діаметрами порівнювали між трьома генотипами CTSB за допомогою тесту χ 2.

Крім того, ми проаналізували розвиток пухлини молочної залози в PyMT; ctsb +/+ (n = 15), PyMT; ctsb +/− (n = 16) та PyMT; ctsb -/- (n = 22) самців мишей (додаткові Рис. S1A). Розвиток пухлини молочної залози у самців пухлинних мишей з дефіцитом CTSB був ще більш суттєво пригнічений у порівнянні з PyMT; ctsb +/+ миші самці. Хоча у 50% PyMT; ctsb +/+ та PyMT; ctsb +/− у самців мишей розвивалися пальпуються пухлини у віці 15 та 18 тижнів відповідно, на розвиток пухлин молочної залози у 50% PyMT пішло 26 тижнів; (P +/+, ctsb -/- і ctsb -/- миші. На відміну від інших генотипів, PyMT; у ctsb -/- мишей не розвивалося пухлин діаметром більше 1 см протягом 1-місячного періоду спостереження. Підсумовуючи, ці результати показують збільшення латентності пухлини та зниження росту пухлини при делеції CTSB у самців та самців мишей PyMT.

Легеневі метастази карцином PyMT та експериментальна колонізація легенів раковими клітинами PyMT. Характерною рисою моделі аденокарциноми миші MMTV-PyMT є розвиток численних легеневих метастазів, які можна спостерігати як макроскопічно, так і мікроскопічно у віці від 3 до 4 місяців (23). Ми підрахували загальний обсяг легеневих метастазів за допомогою автоматизованої стереології на систематично відібраних гістологічних зрізах легенів у самки мишей PyMT усіх трьох експериментальних груп у віці 14 тижнів (24). ANCOVA показав, що крім генотипу (ctsb +/+, ctsb +/− та ctsb -/-), ваги первинної пухлини та зворотного кросу, генерація також мала значний вплив на обсяг метастазів. Крім того, порівняно з групою PyMT; ctsb +/+, обсяг легеневих метастазів зменшився до 45% у групі PyMT; ctsb +/− (P = 0,01) та до 65% у групі PyMT; ctsb -/- (Рис. 2), хоча остання різниця в обсязі метастатичних пухлинних вузликів не досягла статистичної значущості (Р = 0,13).

Вплив дефіциту CTSB на легеневі метастази пухлин молочної залози PyMT. Гістоморфометричне визначення обсягів метастазів у легенях у PyMT; ctsb +/+ (n = 36), PyMT; ctsb +/− (n = 38) та PyMT; ctsb -/- (n = 32) самок мишей у віці 14 тижнів. Коробки, значення між 25-м та 75-м процентилем; квадрати, скориговане середнє значення, отримане ANCOVA (див. Матеріали та методи). Стовпчики, мінімальні та максимальні значення.

Колонізація легенів в/в. вводили клітини PyMT з різним генотипом CTSB вродженим реципієнтам дикого типу. Кількість колоній легенів (A) та середній обсяг колоній пухлини в легеневій тканині (B) після ін'єкції первинного PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− та PyMT; ctsb -/- пухлинні клітини. Загальний об'єм колоній легенів вимірювали за допомогою ПЛР-кількісного визначення в реальному часі трансгену PyMT в геномній ДНК легені, нормалізованій до гена GAPDH. Кількість гена PyMT, поділена на кількість колоній пухлини, дає показник середнього обсягу пухлинних вузликів, одержуваних з клітин PyMT, у окремої миші. Стовпці, середнє; бари, SE. Рівні значущості розраховували за допомогою t-критерію.

Обговорення

Під час прогресування до високої злоякісності пухлинні клітини набувають множинні мутації, що впливають на проліферацію, запрограмовану смерть та генетичну стабільність (29). Крім того, сприятливе мікросередовище має важливе значення для росту, інвазії та метастазування пухлини (1). Протеази, здатні руйнувати білки ECM, нещодавно були визначені критичними регуляторами мікросередовища пухлини. Тут ми показуємо, що лізосомальна цистеїн-протеаза CTSB сприяє зростанню, інвазії та метастатичному процесу PyMT-індукованої карциноми молочної залози.

Підводячи підсумок, нинішні результати свідчать про те, що CTSB, отриманий як з пухлинних, так і з стромальних клітин з мікросередовища, відіграє важливу роль на багатьох стадіях росту та метастазування пухлини. Таким чином, фармакологічне пригнічення позаклітинного CTSB всередині та навколо пухлини непроникними інгібіторами плазматичної мембрани може бути перспективним шляхом ефективного лікування раку.

Подяка

Надати підтримку: Грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 364; B12) 23-7532.22-33-11/1 Ministerium für Wissenschaft und Kunst, Баден-Вюртемберг, та Рамкової програми Європейського Союзу 6, Проект LSHC-CT-2003-503297, Cancerdegradome (A . Крюгер).

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Тому ця стаття повинна бути цим позначена як реклама відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

Дякуємо Сюзанні Доллвет-Мак, Ен Швінде та Ульріке Стабенов (Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Фрайбург, Німеччина) та Каті Хонерт (Institut für Experimentelle Onkologie, Мюнхен, Німеччина) за чудову технічну допомогу.

Виноски

Примітка: Додаткові дані до цієї статті доступні на сайті Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/).

О. Васильєва та А. Папазоглу однаково сприяли цій роботі. Наразі О. Васильєва працює на кафедрі біохімії та молекулярної біології Інституту Йозефа Стефана, Любляна, Словенія. На даний час А. Папазоглу працює у відділенні стереотаксичної нейрохірургії Університетської лікарні Фрайбурга, Фрайбург, Німеччина. Наразі Дж. Дессінг працює в Інституті ім. Макса Планка, Психіатрія, Molekulare Neurogenetik, Мюнхен, Німеччина. Наразі Н. Августин працює на кафедрі математичних наук Університету Бата, Бат, Великобританія.

Надійшла 14 грудня 2005 року.
Редакція отримана 16 лютого 2006 р.
Прийнято 13 березня 2006 року.