Меню списку журналів

Інструменти

Слідкуйте за журналом

Кафедра онкології, Інститут раку Барбари Ен Карманос, Медична школа Університету Уейна, Детройт, Мічиган, США

Кафедра комп'ютерних наук, Університет штату Уейн, Детройт, Мічиган, США

Листування

А. Болліг-Фішер, Барбара Енн Карманос, Інститут раку, 4100 Джон Р. Сент-Детройт, Мічиган, 48201, США

Кафедра комп'ютерних наук, Університет штату Уейн, Детройт, Мічиган, США

Листування

А. Болліг-Фішер, Барбара Енн Карманос, Інститут раку, 4100 Джон Р. Сент-Детройт, Мічиган, 48201, США

Анотація

Скорочення

1. Вступ

За останні 25 років поширеність ожиріння подвоїлася в 70 країнах, включаючи США, і майже третина дорослих людей у всьому світі зараз страждають від надмірної ваги або ожиріння (Афшин та ін., 2017). Зростаюча пандемія ожиріння викликає занепокоєння, оскільки ожиріння є відомим фактором ризику для цілого ряду хронічних, виснажливих або небезпечних для життя захворювань (ВООЗ, 2000), таких як ревматоїдний артрит, цукровий діабет 2 типу, серцево-судинні захворювання та рак (ВООЗ), 2000). Підгрунтям асоціації ризику між ожирінням та цими захворюваннями є накопичення надлишку жирової тканини, що викликає аберрантну вроджену імунну відповідь, що спричиняє місцеве та системне хронічне запалення, ознаками якого є підвищений рівень прозапальних цитокінів, що призводить до збільшення вироблення вільних радикалів, включаючи реактивні види кисню (АФК) (Crujeiras та ін., 2013; Гривенников та ін., 2010 р .; Роча та Ліббі, 2009; Веллен і Готаміслігіл, 2005).

2 Матеріали та методи

2.1 Тестування на зв'язок між рівнями експресії MBD2_v2 пухлини та результатами пацієнта та індексом маси тіла (ІМТ)

2.2 Клітинні лінії, умови культури та аналіз формування мамосфери

Потрійно-негативні клітинні лінії раку молочної залози MDA ‐ MB ‐ 468 та MDA ‐ MB ‐ 231 були отримані з колекції American Type Culture (ATCC, Манассас, штат Вірджинія, США) і регулярно культивовані в 10% модифікованому середовищі Eagle FBS Dulbecco при 37 ° C., 5% СО2. Клітинна лінія TNBC SUM149, розроблена та придбана у Стівена Етьє (Forozan та ін., 1999), культивували в 5% середовищі FBS HAM F-12, що містило 1 мкг · мл -1 гідрокортизону та 5 мкг · мл -1 інсуліну людини. Ці три клітинні лінії представляють молекулярний підтип TNBC. Клітинні лінії аутентифікували за допомогою короткого тандемного повторного аналізу за допомогою системи PowerPlex (r) 16 від Promega (Медісон, штат Вісконсин, США). Наявність і здатність до самовідновлення CSC аналізували в культурах клітин TNBC, використовуючи аналіз формування мамосфери, як проводили раніше (Бао та ін., 2017), і описаний у Shaw та ін. (2012). Сформовані мамосфери підраховували і повідомляли як частку від загальної кількості засіяних клітин (1000). Зображення були зроблені за допомогою мікроскопа Eclipse TE2000 ‐ U (Nikon, Токіо, Японія). Внутрішньоклітинний аналіз MAK164 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) використовували для вимірювання рівня перекису водню в культивованих клітинах.

2.3 Напівкількісний RT-PCR та імуноблот-аналіз

2.4 Стабільний нокдаун SRSF2 та надмірне вираження MBD2_v2 в клітинних лініях

Лентівірусна опосередкована експресія експресії SRSF2 shRNA виконувалась, як описано раніше, за допомогою лентівірусної системи shRNAmir Gentizentrirus shRNAmir Open Biosystems Expression Arrest (Bollig ‐ Fischer та ін., 2011). Клітини MDA ‐ MB ‐ 468 трансдукувались з векторами, націленими на SRSF2 (кат. No RHS4430‐98485060 та RHS4430‐101104677) або на незвучний контрольний вектор. Стабільну надмірну експресію MBD2_v2 в клітинах MDA ‐ MB ‐ 231 проводили, як описано раніше (Бао та ін., 2017). Запаковані лентівірусні частинки для надмірного вираження MBD2_v2 (NM015832.4) або GFP були придбані у Cyagen Biosciences (Санта-Клара, Каліфорнія, США).

2.5 Робота з тваринами

2.6 Профілювання загальної експресії геном пухлин, отриманих від мишей

2.7 Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою r 3.3.2 (http://www.R-project.org/). Графіки були сформовані за допомогою призми r 3.3.2 або графічної панелі (Graphpad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). P значення ≤ 0,05 повідомляються як значущі. Уелча т‐Тест застосовували до напівкількісних даних RT-PCR та даних аналізів мамосфери. Тест Грея на різницю в кумулятивній захворюваності був використаний для оцінки значущості відмінностей, що спостерігаються у частоті утворення пухлини миші та часу до подій між експериментальними групами. Точний тест Фішера використовували для оцінки різниці в частоті утворення пухлини на певну дату. Узагальнені найменші квадрати, що дозволяють проводити кореляційні спостереження у однієї і тієї ж тварини, коли це доцільно (тобто двостороння інокуляція), оцінюючи взаємодію між групою та часом, використовували для перевірки, чи різняться темпи росту пухлини у досліджуваних груп. Середню масу тіла мишей розраховували для чотирьох клітин у кожному стані, до 6 мишей на клітку, вимірювали 2–3 рази на тиждень протягом 185 днів. Для моделювання поздовжніх даних була побудована квадратична модель. Відмінності між групами в даний момент часу порівнювали за допомогою лінійного предиктора з моделі та Стьюдента т‐Тест.

3 Результати

3.1 Асоціації між експресією MBD2_v2 пухлини та результатами пацієнта та ІМТ

Ми припустили, що ожиріння може спричинити збільшення експресії MBD2_v2 для сприяння ініціюванню пухлини фенотипу CSC у клітинах TNBC, встановивши курс на розуміння того, чому ожиріння є фактором ризику для діагностики TNBC та поганих результатів. Щоб встановити правдоподібність нашої гіпотези, пріоритетним було вирішення питання: Чи пов’язані рівні MBD2_v2 у зразках пухлини пацієнтів з ТНБК із результатами виживання та ІМТ? Аналіз з використанням бази даних Plotter KM (Gyorffy та ін., 2010), тестування на зв'язок між рівнем транскриптів генів та виживанням без рецидиву серед 246 зразків, показало, що висока експресія MBD2_v2 у пухлинах пацієнтів з ТНБК асоціюється з високим рівнем рецидиву [коефіцієнт ризику (HR) = 1,66, P = 0,05, рис. 1А]. У базі даних KM Plotter відсутні дані ІМТ. Щоб перевірити взаємозв'язок між ІМТ пацієнта та експресією транскриптів пухлини, ми використали інший існуючий набір даних про експресію генів на основі зонда, що включає 59 зразків TNBC з відомим статусом ІМТ, зібраних у KCI (таблиця S1). Лінійний регресійний аналіз показав, що існує позитивна асоціація експресії MBD2_v2 та ІМТ (P = 0,04, кореляція 0,27, рис. 1В), а рівні експресії MBD2_v2 значно збільшені у пухлин у пацієнтів з ІМТ ≥ 30 порівняно з пухлинами у пацієнтів з ІМТ

3.2 Збільшення частоти формування пухлини та експресії MBD2_v2 пухлини у мишей DIO

Ці експерименти були розроблені для порівняння показників утворення пухлини, але була побудована маса пухлини (рис. 2D, E). Верхні нахили кривих зростання подібні, що вказує на те, що DIO мало або зовсім не впливав на темпи зростання встановлених пухлин MDA-MB-468 або MDA-MB-231. Ми провели напівкількісний RT-PCR аналіз експресії пухлини MBD2_v2. Рівні MBD2_v2 були вищими у пухлин, отриманих від мишей DIO, порівняно з пухлинами, отриманих від контрольних мишей (P

3.3 Збільшення експресії MBD2_v2 у клітинах TNBC збільшує здатність ініціювати пухлину

3.4 Експресія MBD2_v2 клітини TNBC залежить від експресії чутливого до антиоксидантів SRSF2

Повідомляється, що фактор сплайсингу SRSF2 необхідний для експресії альтернативного варіанта мРНК сплайсингу MBD2_v2 в плюрипотентних стовбурових клітинах людини (hPSC) (Lu та ін., 2014). Ми розробили набір експериментів, щоб вивчити, чи існує однаковий регуляторний зв’язок між SRSF2 та MBD2_v2 у клітинах TNBC. По-перше, ми спостерігали, що вираз SRSF2 подібний до MBD2_v2 (Bao та ін., 2017), що підлягає антиоксидантно-чутливій АФК-регуляції в клітинах TNBC. Використовуючи клітинні лінії TNBC MDA ‐ MB ‐ 468 та SUM149, які виражали аналогічно великі ендогенні рівні SRSF2, (-) - антиоксидантна обробка епікатехіном знижувала рівні АФК та MBD2_v2 (рис. S5) та регулювала рівень мРНК та білка SRSF2 (рис. 4А, Б). Потім ми встановили два незалежні нокдауни SRSF2 (використовуючи дві унікальні послідовності shRNA) та несумогульні векторні контрольні клітинні лінії MDA ‐ MB ‐ 468. Нокдаун SRSF2 призвів до зниження рівня білка MBD2_v2 та рівня мРНК (рис. 4C, D). Згідно з тестами формування мамосфери, нокдаун SRSF2 також призвів до зменшення кількості мамосфер (рис. 4E) та зменшення розміру тих, хто вижив (рис. 4F). У цілому це характеризує роль регуляторної осі SRSF2 – MBD2_v2, що залежить від АФК, у клітинах TNBC.

3.5 Експресія пухлини SRSF2 збільшена у мишей DIO, і зниження регуляції SRSF2 перешкоджає здатності клітин TNBC ініціювати пухлину

Ми провели напівкількісний RT-PCR-аналіз для експресії SRSF2 у пухлинах, зібраних з DIO та контрольних мишей. Як і MBD2_v2 (рис. 2F), рівні SRSF2 були стабільно вищими у пухлинах, отриманих від мишей DIO (P 2014). Згідно з напівкількісним RT-PCR-аналізом, нокдаун SRSF2 був втрачений у встановлених пухлинах (рис. S6). Крім того, висока експресія SRSF2 у пухлинах пацієнтів з ТНБК асоціюється з високими показниками рецидивів (HR = 1,57, P = 0,04, база даних Plotter KM, рис. 5C). Однак аналіз набору даних KCI, який виявив зв'язок між MBD2_v2 та ІМТ (рис. 1B, C), не зміг виявити зв'язок між експресією SRSF2 та ІМТ (рис. S6).

4 Обговорення

Для експериментів, спрямованих на більш безпосередню оцінку того, чи підвищена експресія MBD2_v2 та SRSF2 відіграє причинну роль у збільшенні утворення пухлин, ми стабільно змінили рівні MBD2_v2 або SRSF2 у клітинах TNBC до інокуляції. Надмірна експресія MBD2_v2 суттєво збільшила здатність ініціювати пухлину клітин TNBC у худих мишей, а нокдаун SRSF2, який зменшив експресію MBD2_v2, суттєво ускладнив здатність до утворення пухлини в більш пухлинному контексті мишей DIO. Раніше була встановлена актуальність експериментальної методології посіву мишей на ракові клітини для вимірювання ефективності пухлинного утворення або пухлинності (Al ‐ Hajj та ін., 2003). Дослідники відзначають, що відносно невелика кількість клітин, що демонструють фенотип CSC, здатні макроколонізуватися і згодом утворювати пухлини у мишей, але більша кількість клітин з альтернативними фенотипами, які називаються масовими раковими клітинами, не макроколонізуються (Аль-Хадж та ін., 2003).

5 Висновок

Поточний звіт описує докази того, що експресія MBD2_v2 реагує на ожиріння та зумовлює пухлинність ТНБК, і, таким чином, надає молекулярні уявлення на підтвердження епідеміологічних доказів того, що ожиріння є фактором ризику для ТНБК. Більшість пацієнтів з TNBC страждають ожирінням (Trivers та ін., 2009; Вона-Девіс та ін., 2008) та підвищення рівня ожиріння загрожують подальшим збільшенням тягаря раку, пов'язаного з ожирінням (Пірсон-Статтард та ін., 2018), що підсилює актуальність цієї галузі дослідження.

Подяки

Цю роботу підтримав Катарський національний дослідницький фонд (NPRP7‐363‐3‐089, присуджений АБФ). NIH: Центр NCI надав Інституту раку Карманоса P30 CA022453 підтримку з біостатистики, біобанкінгу та корелятивних наук, а також оцінку моделей тварин та терапевтичних засобів.

Конфлікт інтересів

Автори не заявляють конфлікту інтересів.

Внески автора

ABF задумав і контролював дослідження. EAT та BB проводили молекулярні та клітинні експерименти. LAP контролював експерименти та догляд за тваринами. KSP згенерував дані про людські зразки. EAT, CM, GD та ABF аналізували дані. LAP, RMM, GD, KSP та ABF надали досвід та необхідні матеріали. EAT та ABF написали рукопис із відгуками всіх авторів. Усі автори прочитали та схвалили остаточний рукопис.

Рис. S1. Відскановані фільми повнометражних плям.

Рис. S2. Аналіз експресії MBD2_v1 у пухлинах пацієнта.

Рис. S3. Експресія MBD2_v2 у культурах клітинних ліній TNBC перед інокуляцією миші.

Рис. S4. MBD2_v2 надмірного вираження та GFP, що виражає криві росту пухлини.

Рис. S5. Вплив (-) - лікування епікатехіном на рівні АФК та MBD2_v2 у культурах клітин TNBC.

Рис. S6. Зниження рівня пухлини та кривих росту SRSF2 та експресія SRSF2 пухлини пацієнта, пов’язана з ІМТ.

Рис. S7. Ожиріння вісцеральної системи, рівні окисного стресу та збагачення генів сигнального шляху у пухлинах, порівнюючи DIO та контрольних мишей.

Рис. S8. NANOG у культурах клітинних ліній TNBC та пухлинах.

Таблиця S1. Експресія гена пухлини пацієнта та дані ІМТ.

Зверніть увагу: Видавець не несе відповідальності за зміст або функціональність будь-якої допоміжної інформації, наданої авторами. Будь-які запити (крім відсутнього вмісту) слід направляти до відповідного автора статті.

Афшин А, Форузанфар М.Х., Рейтсма М.Б., Сур П., Естеп К, Лі А, Марчак Л., Мокдад А.Х., Мораді-Лакех М., Нагаві М., та ін. (2017) Вплив зайвої ваги та ожиріння на здоров’я в 195 країнах протягом 25 років . N Engl J Med 377, 13 - 27 .

Кількість цитовань відповідно до CrossRef: 6

Ilaria Chiodi, Chiara Mondello, Фактори життєвого стилю, пластичність пухлинних клітин і ракові стовбурові клітини, Дослідження мутацій/Відгуки в дослідженні мутацій, 10.1016/j.mrrev.2020.108308, (108308), (2020).

MBD2 корелює з поганим прогнозом та прогресуванням пухлини при карциномі нирок

Ожиріння, ароматаза та рак молочної залози Експертний огляд ендокринології та метаболізму Том 6, No 3

Ожиріння, пов’язане з гіршими психосоціальними результатами серед пацієнтів з раком молочної залози та простати

Стійкість тканин молочної залози у жінок, що страждають ожирінням, сприяє розвитку пухлин Сандри та Едварда Мейєра

Результати ожиріння, діабету та виживання у великої когорти хворих на рак молочної залози на ранніх стадіях -

Ожиріння та результати у молодих хворих на рак молочної залози у Великобританії, дослідження POSH - ScienceDirect