Секвенування геному та аналіз транскриптомів гіпоталамуса сибірського хом’яка визначають механізми сезонного енергетичного балансу

Відредаговано Дональдом Пфаффом, Університет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк, та затверджено 13 травня 2019 року (отримано на огляд 18 лютого 2019 року)

Значимість

Геном та гіпоталамусний транскриптом сибірського хом'яка були послідовно прокомментовані та анотовані для виявлення транскрипційних шляхів, які демонструють сезонну пластичність в енергетичному балансі. Адаптація до коротких зимових днів змінила сезонне ожиріння та знизив регульований гіпоталамусом проопіомеланокортин, а екзогенний трийодтиронін відновив збільшення ваги та експресію проопіомеланокортину. В ході силіко-аналізів виявлено еволюцію мотивів зв'язування рецепторів гормонів щитовидної залози в проксимальному промоторі гена проопіомеланокортину хом'яків та інших крисетидів. Енергетичні виклики, накладені обмеженням їжі, викликали орексигенну та анорексигенну нейропептидну реакцію в гіпоталамусі, але не вплинули на проопіомеланокортин, який регулювався лише фотоперіодом. Гіпоталамічний проопіомеланокортин підтримується завдяки сигналу трийодтироніну, керованому фотоперіодом, і тим самим забезпечує адаптивну довгострокову тимчасову організацію фізіологічних систем, що регулюють енергетичний баланс.

Анотація

Реостатична регуляція фізіологічних процесів є поширеною (1), і яскравим прикладом є природне, довготривале запрограмоване сезонне відтворення та енергетичний баланс. Сезонні цикли високої амплітуди в енергетичному балансі та соматичному зростанні є загальноприйнятими в природі і дають унікальну та цінну можливість виявити геномні та молекулярні шляхи, що беруть участь у реостатичному контролі фізіології (2 ⇓ ⇓ –5). Сибірські хом'яки (Phodopus sungorus) демонструють помітні зміни в енергетичному балансі, коли вони адаптуються від літнього до зимового середовища в природі: зменшення тривалості дня (тобто світлового періоду) нижче ∼ 13 год. Світловий день викликає сезонне безпліддя, анорексію та різке зменшення жиру в організмі (2). Отже, Phodopus забезпечує унікальну та важливу модель нейроендокринних, фізіологічних та поведінкових механізмів, які регулюють довгострокову сезонну регуляцію маси тіла та розмноження (2, 5); ці стійкі фенотипові зміни у фізіології та поведінці можна повторити в лабораторії лише маніпуляціями з тривалістю дня (фотоперіоду).

Результати і обговорення

Характеристика геному сибірського хом'яка та фотоперіодичного проміжного мозку.

Довготривала фотоперіодична регуляція експресії гіпоталамуса. Середнє значення ± SEM (A) зміни маси тіла та (B) експресії мРНК pomc гіпоталамусу у дорослих чоловіків сибірських хом'яків після 8 тижнів впливу LD (сині смуги) або SD (червоні смуги) та 2 тижні щоденної обробки Т3 (5 мкг; sc). (A) Лікування Т3 збільшило масу тіла при ЛД та СД (*** P 0,30; Додаток SI, Рис. S6). Неадекватність лише Т3 в рушінні активності люциферази в цьому аналізі може вказувати на необхідність додаткових внутрішньоклітинних сигнальних шляхів або на те, що функціональна регуляція транскрипції, керована Т3, на проксимальному промоторі помп вимагає дистальних підсилювальних елементів.

Регулювання експресії гіпоталамічної помпи за фотоперіодом проти їжі.

POMC як такий є функціонально інертним, але він розщеплюється на безліч пептидів, один з яких, α-меланоцитостимулюючий гормон, є потужним інгібітором прийому їжі (23). Миші-нокаути мають ожиріння (24), а гостре голодування помітно знижує рівень експресії помти, що свідчить про його центральну роль в енергетичному гомеостазі (25). Таким чином, ми оцінили вплив гострого обмеження їжі на масу тіла та реакції нейропептидів гіпоталамусу, пов’язаних з енергетичним гомеостазом (pomc, cart, npy та argp). Самці і самки хом'яків гостро (16 год) отримували обмежене харчування (FR) через 12 тижнів адаптації до фотоперіодів LD або SD. Знову ж таки, хом'яки важили менше в SD (P 0,05; рис. 2E), що відповідає попереднім повідомленням (16 ⇓ –18). Взяті разом, ці дані вказують на те, що гіпоталамусова помпа не стримується гострим негативним енергетичним балансом у сибірських хом'яків, але підтримують гіпотезу про те, що експресія помк натомість пов'язана з більш тривалими (сезонними) станами метаболічних змін, зокрема, пов'язаними з прогнозованими змінами в організмі вага та метаболізм, пов’язані із сезонними/фотопериодичними корекціями.

Загальна дискусія

Сибірські хом'яки стали ключовим модельним видом для дослідження біологічних ритмів на річному масштабі часу (26, 27). Геном хом'яка, розроблений у цій роботі, в поєднанні з поширеністю збагачення для POMC-сигналізації в даних RNA-seq безпосередньо полегшив ідентифікацію вставних мотивів, що зв'язують Thrb, у проксимальному промоторі, який згодом також був ідентифікований у сезонно розмножуваному сирійському хом'яків, оленячих мишей і прерійних полівки. Однією з заслуговуючих на увагу закономірностей було збільшення експресії помп у LD хом'яків, які захищають вищу масу тіла і класифікуються як ожиріння. Спостереження, засноване на загальноприйнятих біомедичних моделях ссавців, наприклад, на мишах та людях, полягає в тому, що pomc надає анорексигенні ефекти на споживання їжі та апетит через сплавлення РНК, спрямовану на вироблення α-MSH як основного нейропептиду. Однак у сибірських хом'яків дії pomc можуть бути зумовлені посттрансляційними модифікаціями, такими як підвищена експресія карбоксипептидази Е для стимулювання альтернативного нарізання pomc та синтезу нейропептидів (28).

Результати експерименту 4 дають збіжні докази на підтримку POMC як головного кандидата на тривале фотоперіодичне регулювання енергетичного балансу, незалежно від короткочасних енергетичних сигналів. FR викликав очікуване збільшення npy та agrp, але був абсолютно неефективним у пригніченні pomc, підтверджуючи інші повідомлення про цей вид (16 ⇓ –18). Дійсно, у хом'яків SD спостерігалося незначне парадоксальне збільшення питомості, що може відображати додатковий рівень фотопериодичної модуляції реакції на позбавлення їжі. Попередні роботи вказували на відносну нечутливість гіпоталамічної помпи, маси тіла, лютеїнізуючого гормону або фолікулостимулюючого гормону до лептину у хом'яків LD (16). У сукупності ці дані вказують на те, що експресія гіпоталамусної помпи регулюється довгостроковими прогнозуючими сигналами, такими як фотоперіод (ймовірно, за допомогою сигналізації Т3), незалежно від більш близьких енергетичних сигналів, таких як ті, що посилаються на короткочасну доступність їжі (наприклад, FR) або ожиріння ( тобто лептин).

Нарешті, наявність анотованого геному та гіпоталамусного транскриптома сильно сезонного ссавця може дозволити глибше зрозуміти молекулярні сигнальні шляхи, які перетворюють сигнали навколишнього середовища на сезонні біологічні сигнали, що важливо для розуміння та пом'якшення впливу сезонних порушень на здоров'я та стан здоров'я. -буття у людей та нелюдських тварин (34).

Методи та матеріали

Додаткові деталі експериментальних протоколів описані в Додатку SI.

Використання тварин та етика.

Усі процедури були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин в Чиказькому університеті, Національним керівництвом інститутів охорони здоров'я щодо догляду та використання лабораторних тварин (35) або Комісією з огляду добробуту та етики тварин в Університеті Абердіна, проводились за ліцензією Міністерства внутрішніх справ (PPL 70/7917). Всі процедури відповідали вимогам ARRIVE. У цих дослідженнях використовували сибірських хом'яків (P. sungorus). Хом'яки були розміщені в клітинах з поліпропілену, освітлених протягом 15 годин або 9 годин на день (LD або SD відповідно; світло вимикається о 1700 годині CST). Харчування [Teklad (раніше Harlan)] та відфільтрована водопровідна вода надавались за бажанням.

Секвенування геномів, аналіз De Novo та аналіз транскриптомів.

Процес аналізу даних для складання та анотації геному викладений у додатку SI, рис. S1. Геномну ДНК екстрагували з тканини печінки двох дорослих чоловіків-хом'яків за допомогою DNeasy (Qiagen; каталог №69504), і кількість визначали за допомогою спектрофотометрії Nanodrop (ThermoFisher Scientific). Було підготовлено одну парну бібліотеку з розміром вставки розміром 250 п.н. на інструменті Illumina HiSeq2000 в Геномному фонді Університету Чикаго. Загалом було сформовано 918 мільйонів зчитувань парного кінця на 100 біт, досягаючи глибини 37 × (Додаток SI, таблиця S1). РНК гіпоталамуса екстрагували за допомогою Qiagen RNeasy (каталог № 74104), і кількість оцінювали за допомогою Nanodrop. Парні бібліотеки були підготовлені та послідовно розподілені на інструменті Illumina HiSeq 2000 у Геномному фонді Університету Чикаго. Транскриптом реконструйовано за допомогою конвеєра Trinity de novo (v2013-02-25) (36). Транскрипти, різницево виражені між групами, були ідентифіковані як на рівні гена, так і на рівні ізоформи, використовуючи пакет BioRunductor edgeR (37), із зразками тієї ж групи як біологічні копії в групі. Див. Додаток SI, таблицю S2 щодо змін складки виразів та значень P, скоригованих FDR.

Кількісна оцінка експресії гіпоталамічної РНК.

Гіпоталамус розкривали та вимірювали експресію tshβ, дейодинази типу II (діо2) та дейодинази типу III (діо3) для підтвердження маніпуляцій з фотоперіодом (Додаток SI). РНК гіпоталамуса екстрагували з тканин за допомогою TRIzol (ThermoFisher Scientific). кДНК синтезували за допомогою SuperScript III (Invitrogen), і кДНК зберігали при -20 ° C. qPCR для експресії мРНК у тканині гіпоталамусу проводили за допомогою Bio-Rad CFX96. Додаток SI, таблиця S5, описує параметри qPCR для кожної цільової та еталонної розшифровки. Ми використовували PCR Miner (38) для розрахунку ефективності реакції та порогів циклу, а зразки оцінювали на основі Мінімальної інформації для публікації кількісних рекомендацій щодо ПЛР у реальному часі (39).

In Situ Гібридизація виділених фотоперіодичних генів.

Розподіл мРНК виділених фотоперіодичних генів (tshβ, dio2, dio3, pomc) досліджували в корональних гіпоталамусових зрізах шляхом радіоактивної гібридизації in situ. Зрізи гіпоталамуса товщиною двадцять мікрон вирізали і встановили на предметні стекла, покриті поліліллізином. Рибозонди генерували з клонованих фрагментів, генерованих ПЛР, як описано раніше (33). Гібридизацію in situ проводили, як описано раніше (40).

Фотоперіодична та трийодтиронінова регуляція пом.

Хом'яків розміщували групою в LD (n = 15) або переносили в шафи SD (9L: 15D; n = 16) на 8 тижнів (Arrowmight). Потім хом'яків LD і SD розділили на дві групи лікування, які отримували щоденний контроль сольового розчину (LD + S та SD + S) або ін'єкції 5-мкг T3 (LD + T3 та SD + T3). Кінцевими розмірами зразків для групи лікування були LD + S (n = 9), LD + T3 (n = 6), SD + S (n = 8) та SD + T3 (n = 8). Ці режими доз та ін'єкцій були обрані на основі попередньої роботи (41 ⇓ –43).

Вплив обмеження їжі на вираженість пори.

У цьому експерименті використовували дорослих (віком ~ 6 міс; n = 23) чоловічих і жіночих сибірських хом'яків. Хом'яків поселяли в LD (n = 12) або переносили в SD протягом 12 тижнів. Ваги тіла вимірювали перед фотопериодичною обробкою (0 тижнів), а потім через 2 тижні через 12 тижнів, незадовго до вимкнення світла. В останній день експерименту підгрупу хом'яків LD та SD тримали на їжі ad libitum (n = 10) або їжу повністю видаляли (тобто обмеження їжі; FR, n = 13). FR розпочався безпосередньо перед вимкненням вогнів останньої ночі. Загалом існувало чотири експериментальні групи: ЛД з лібітом (n = 5), СД з лібітом (n = 5), LD-FR (n = 7) та SD-FR (n = 6).

Статистичний аналіз.

Sigmaplot використовувався для всіх статистичних аналізів, якщо не вказано інше. Для експериментів 2 та 4 ми провели повторні двосторонні ANOVA для вивчення впливу лікування СД на масу тіла. Ми провели двосторонні ANOVA для експерименту 2 (фактори: фотоперіод проти ін’єкції Т3) та експерименту 4 (фактори: фотоперіод та обмеження їжі), щоб проаналізувати вплив щоденних ін’єкцій Т3 або обмеження їжі на зміну маси тіла та експресії гена гіпоталамуса . Значимість була визначена за P 1, кому може бути адресована кореспонденція. Електронна адреса: tyler.stevensonglasgow.ac.uk .

гіпоталамуса