Ідентифікація слинних та плазмових біомаркерів на ожиріння у дітей шляхом нецільового метаболомічного аналізу

Анотація

Хімічні сполуки в слині, які, найімовірніше, пов’язані з ожирінням, виявляються під час метаболомічного аналізу парних зразків цілої слини та плазми у 68 дітей (10-річного віку), яких також оцінювали на предмет почервоніння ясен.

Результати Завдяки метаболомічному аналізу119 сполуки були виявлені лише в слині, 210 лише в плазмі та 126 в обох. Найпоширенішими метаболітами плазми були ліпіди. Найпоширенішими метаболітами слини були пептиди. Амінокислоти та їх метаболіти були поширеними в обох зразках.

Сурогатні показники визначали шляхом обчислення кореляційних зв'язків між слиною та плазмою. 29 із 126 виявлених як у слині, так і в плазмі мали значну позитивну кореляцію, і лише 4 з них (урати, креатинін, піпеколат та гідроксипролін) були пов’язані з ожирінням як потенційними сурогатними біомаркерами. Уремічний токсин N1-метил-2-піридон-5-карбоксамід (2PY) також був підвищений у слині дітей із ожирінням. 21 біохімічна речовина була підвищена як при ожирінні, так і при гінгівіті, що свідчить про те, що деякі біохімічні шляхи розвитку гінгівіту та ожиріння є спільними.

З метаболітів, виявлених лише у слині, 35 були пов’язані з ожирінням (пробірки для зберігання р ® 2D із кодованим штрихкодом ScrewTop ®, Thermo Fisher Scientific Inc., Хадсон, штат Нью-Гемпшир) і зчитувалися за допомогою зчитувача штрих-кодів (Thermo Scientific VisionMate ® ST Считувач штрих-кодів, Thermo Fisher Scientific Inc., Хадсон, штат Нью-Гемпшир), за яким номер учасника співвідносився з номером вибірки.

Кров відбирав флеботоміст із серединної ліктьової артерії (BD Hemogard plus, K2 BD367863, лавандова кришка), центрифугував 10 хвилин при 2000 х г у холодильній центрифузі. Зразки слини та плазми зберігали до -80 ° C до аналізу.

Клінічні оцінки

Усі клінічні оцінки проводились підготовленими експертами. Висоту вимірювали стадіометром, а вагу - каліброваною вагою у ванній кімнаті. Артеріальний тиск і частоту серцевих скорочень вимірювали за допомогою автоматичного зчитування манжети після того, як діти 10 хвилин спокійно сиділи. Стоматологічні вимірювання проводили за допомогою переносного дитячого стоматологічного крісла, внутрішньоротового світла та ротового дзеркала. Гінгівіт оцінювали шляхом підрахунку кількості червоних ділянок ясен (мезіальних, щічних, дистальних та мовних кожних зубів) стоматологічним персоналом. Розпад зубів оцінювали шляхом підрахунку кількості зубів (як молочних, так і постійних), які мали видимий карієс або були заповнені. У цьому дослідженні не використовувались ні зубні зонди, ні рентгенограми.

Метаболомічний аналіз

Аналізували аликвоти 120 мкл супернатантів слини та зразків плазми від кожного учасника. Відносні кількості кожного метаболіту отримували інтегруванням піків, виявлених на нецільовій метаболічній платформі профілювання (Metabolon®, Durham, North Carolina), використовуючи високоефективну рідинну хроматографію/тандемну мас-спектрометрію (HPLC-MS/MS та газову хроматографію-мас-спектрометрію) MS) для летких видів [2]. З'єднання ідентифікували шляхом узгодження хроматографічного часу утримання та підписів мас-спектральної фрагментації з даними бібліотеки посилань, створених на основі справжніх стандартів.

Аналіз даних

Всі 455 біохімічних речовин, виявлених у слині, плазмі або обох, пройшли три рівні аналізу. Першим аналізом було визначити, чи біохімічна речовина слини може бути сурогатом плазми. Другий аналіз полягав у визначенні того, чи передбачає біохімік ожиріння. Третім аналізом було визначити біохімічний прогноз гінгівіту, гіпертонії або карієсу зубів. Інформація про пацієнта та кількісні дані цього дослідження наведені в додаткових таблицях. Таблиця S1 містить клінічні категоричні дані. Таблиця S2 містить дані для слини, а таблиця S3 - дані для плазми. Тільки ті біохімікати з р-значеннями для ожиріння ≤ 0,01 були збережені в таблицях основного тексту.

На первинному рівні був проведений аналіз для визначення кореляції між рівнями слини та рівнями плазми крові, що ідентифікує ті біохімікати в слині, які можуть бути безпосередньо пов’язані з плазмою. Цей аналіз, якщо позитивний та значущий, вказує на те, чи існує позитивний коефіцієнт розподілу між відділами плазми та цілої слини. Якщо вони негативні або незначні, то, ймовірно, немає взаємозв’язку між рівнем слини та плазми крові, так що ці змінні навряд чи є сурогатними кандидатами. Однак це передбачає, що концентрація як у слині, так і в плазмі знаходиться в межах чутливості до вимірювання за допомогою мас-спектрометричного методу.

На середньому рівні здатність передбачати, чи страждає ожиріння, перевіряється непараметричною статистикою (U-тест Манна-Уітні). Якщо цей показник був значним, біохімічна речовина була визначена як потенційний біомаркер для ожиріння. Якщо ні, його відкидали. Цей аналіз був доповнений визначенням площі під робочою кривою приймача (AUROC). Цей показник є узагальненим показником точності кількісного діагностичного тесту, який можна інтерпретувати як середню чутливість для всіх можливих значень специфічності [3]. Значення для AUROC визначали з метаболомічних даних за допомогою програмного забезпечення MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/).

Для третього рівня за допомогою непараметричної статистики перевірялася здатність передбачати, чи має суб’єкт гінгівіт, карієс зубів або високий кров’яний тиск. Результати вказують, чи будь-яка біохімічна речовина (у слині чи плазмі) була потенційним біомаркером для цих захворювань та чи не суперечило це виявленню ожиріння.

Клінічна оцінка: У дитини з ожирінням було визначено, що вона має ≥95-й процентиль за індексом маси тіла (ІМТ) (https://nccd.cdc.gov/dnpabmi/Calculator.aspx). Дитина з гінгівітом визначалася як така, у якої більше середнього відсотка червоних ділянок ясен (10,6% ділянок червоних). Діти з карієсом визначались як діти з будь-яким видимим карієсом на будь-якому зубі. Гіпертонічну хворобу визначали як систолічний артеріальний тиск ≥ 130 мм рт.ст.

Результати і обговорення

Демографія пацієнта

З 68 обстежених дітей (таблиця 1) 22 страждали ожирінням (16 чоловіків, 6 жінок) і 46 не страждали ожирінням (6 чоловіків, 40 жінок) із середнім віком 10,7 ± 0,2 року. Середній ІМТ, окружність талії, маса тіла, гіперемія ясен, зріст, вік та систолічний артеріальний тиск у дітей із ожирінням були значно більшими у дітей із ожирінням. Не було помічено різниці в діастолічному артеріальному тиску чи карієсі.

Антропоморфні та клінічні характеристики досліджуваної популяції, згруповані за ожирінням. Перераховані значення є середнім значенням ± стандартна помилка. p-значення відносяться до аналізу за допомогою t-критерію.

Поширення біохімікатів

У зразках супернатанту плазми та центрифугованої слини було виявлено загальну кількість 455 унікальних біохімікатів (рис. 1). 119 (26%) виявлено лише у слині, 210 (46%) виявлено лише у плазмі та 126 (28%) виявлено як у плазмі, так і в слині.

Більшість біохімічних речовин, які є спільними між слиною та плазмою, були амінокислотами та їх метаболітами (рис. 1). У слині пептиди були найбільш часто зустрічаються біохімічними речовинами. У плазмі найпоширенішими були ліпіди. 109 (77%) видів ліпідів, виявлених у плазмі, не виявлено в слині, а 48 (91%) пептидів, виявлених у слині, не виявлено в плазмі.

Аналіз на ожиріння, гінгівіт, карієс та артеріальну гіпертензію продемонстрував, що ожиріння найбільше представлене як метаболітами слини, так і плазми (рис. 2). Ожиріння було достовірно (р ≤ 0,01) пов’язане з 39 біохімічними речовинами як за допомогою аналізу слин (таблиця 3), так і для 64 методом аналізу в плазмі крові (таблиця 4).

Сурогатні біохімікати

Аналіз слини та плазми виявив 29 біохімікатів зі значною позитивною кореляцією (табл. 2). Рівні слини у верхній чотири (піпеколат, креатинін, транс-4-гідроксипролін та урат) також були суттєво пов'язані з ожирінням. Регресійний аналіз цих біохімічних речовин (рис. 3) показує, що ці чотири метаболіти суттєво корелювали.

Піпеколад є метаболітом лізину, який міститься в сечі, плазмі, слині та лікворі людини, який, ймовірно, походить або від з’їденої їжі, або від бактеріального обміну. У нашому дослідженні значну асоціацію виявили лише у слині. Недавні дослідження показують, що піпеколева кислота плазми, особливо D-ізомер, походить головним чином від катаболізму харчового лізину кишковими бактеріями, а не від безпосереднього прийому їжі. У бактеріях піпеколат бере участь у синтезі антибіотиків для деяких видів [4]. Він підвищений у плазмі крові у пацієнтів із синдромом Зеллвегера та при хронічних захворюваннях печінки [5]. Піпеколад також був важливим показником гінгівіту (табл. 2).

Біохімікати (n = 29) зі значною кореляцією (p ≤ 0,01) між слиною та плазмою відсортовані в порядку p-значення для прогнозування ожиріння p (ожиріння) за біохімічними речовинами слини. N - кількість дітей, у яких була виявлена біохімічна речовина. Кореляція p - значення p кореляції між значеннями слини та плазми. AUROC - це область під кривою ROC, яка передбачає ожиріння як однофакторний провісник. Значення кратності - це відношення середнього значення для дітей із ожирінням, поділене до середнього значення для дітей, які не страждають ожирінням. Включені значення P для прогнозування гінгівіту, карієсу та гіпертонії в слині та плазмі.

Креатинін є метаболітом креатинінфосфату, який виділяється з м’язів з відносно постійною швидкістю. Рівні креатиніну в крові (100 мМ = 1 мг/дл) є клінічно важливими, оскільки вони використовуються для оцінки швидкості клубочкової фільтрації. З біомаркерів у нашому дослідженні креатинін мав найвищу кількість слини: вимірювали кореляційну залежність плазми (0,48), що свідчить про те, що концентрація цього метаболіту в слині є сурогатом рівня плазми. Значно підвищений рівень креатиніну в слині спостерігався у дітей із ожирінням (табл. 2), що також свідчить про можливу асоціацію із захворюваннями нирок [6]. Дані таблиці 2 та рисунку 3 свідчать про те, що креатинін слини може використовуватися як сурогатна змінна (AUROC = 0,73) для креатиніну в крові та як показник розвитку ожиріння.

Транс-4-гідроксипролін в слині часто пов'язаний з ферментативним перетравленням колагену при гінгівіті та пародонтозі. Однак асоціація, виявлена в цьому дослідженні, припускає можливу модуляцію ожирінням. Наші дані вказують на відсутність суттєвої асоціації. Хоча рівні транс-4-гідроксипроліну в слині та плазмі позитивно корелювали (p = 0,002, таблиця 2), лише рівні слини вказували на ожиріння (p = 0,003 для слини та p = 0,61 для плазми), що свідчить про взаємодію між запальними станами ожиріння та гінгівіту. Рівні транс-4-гідроксипроліну в плазмі крові не були суттєво пов'язані з ожирінням.

Урат загальновизнаний як маркер ожиріння [7], ожиріння та клубочкової фільтрації [8]. Інші вказували, що це маркер запалення, дисфункції ендотелію та підвищених показників метаболічного синдрому [9]. Багато хто вважає, що він має причинну роль у розвитку діабету завдяки його ролі в метаболізмі фруктози [10]. У своєму дослідженні ми наводимо докази того, що урат слини є сурогатом уратів плазми (табл. 3). Наші результати також вказують на справедливу однозначну величину прогнозу (AUROC = 0,68) для ожиріння.

Біохімічні речовини (n = 21) в слині, пов’язані як із ожирінням, так і з гінгівітом, відсортовані за значенням р для ожиріння. Відсік: S = лише слина, B = як плазма, так і слина. Співвідношення призначене лише для відсіку В. Рейтинг базується на мінімальному значенні р для ожиріння та гінгівіту.

Біохімічні речовини слини, пов’язані як із ожирінням, так і з гінгівітом

Двадцять одна біохімічна речовина слини була суттєво пов’язана як з ожирінням, так і з гінгівітом (табл. 3), що припускає, що між цими двома запальними захворюваннями можуть існувати загальні біохімічні шляхи. Вивчення відділів біохімікатів у таблиці 2 вказує на те, що за одним винятком (піпеколад), усі біохімікати містяться або лише в слині (відсік = S), або не суттєво корелюють між слиною та плазмою. Отже, усі біохімічні речовини, пов’язані як з ожирінням, так і з гінгівітом, по суті були обмежені лише слиною.

Гідроксифенілактат з’являється на другому рівні як при ожирінні, так і при слині. У біології ссавців це метаболіт тирозину, але також синтезується як D-форма пероральними бактеріями з фенольних сполук

Алантоїн виявляється на четвертому рівні при ожирінні і на третьому - при гінгівіті, і виробляється тваринами, рослинами та бактеріями. Алантоїн - це продукт метаболізму пуринів, який, як вважають деякі, є мірою окисного стресу [11].

Біохімікати містяться лише в слині

Біохімікати, визначені як потенційні біомаркери ожиріння, виявляються лише у слині (n = 35), відсортованій за здатністю ідентифікувати дітей із ожирінням (p≤ 0,01). Ці дані включають дані, виявлені лише в слині (компартмент = S), і ті, що знаходяться в обох (компартмент B), кореляція слини/плазми яких ≤0,01. Інші змінні - це ті, що визначені в таблиці 2.

Біохімічні речовини слини, суттєво пов’язані з ожирінням (n = 35), перераховані в таблиці 4. Із цих біохімічних речовин, пов’язаних із ожирінням, 21 також був значно збільшений у дітей із гінгівітом. Зі 126 біохімікатів, виявлених як у слині, так і в плазмі, 35 + 4 = 39 було виявлено, що значно (р 0,3)). Найбільш передбачуваним пептидом (р = 0,002) ожиріння був цикло (глі-фе) (Таблиця 3).

Біохімікати містяться лише в плазмі

Серотонін зниження плазми було дуже значним у дітей із ожирінням. Препарати для депресії та антидепресанти пов'язані з підвищеним ризиком ожиріння, мабуть, через зниження рівня серотоніну або транспортера серотоніну [24, 25].

Знижений серотонін був виявлений у пуповинній крові, де це зниження було пов’язане зі швидким збільшенням маси тіла після пологів [26]. Розуміння функції серотоніну було широко розширено, включаючи ожиріння та діабет [25].

Насичені ліпіди (капроат, гептаноат-каприлат, пеларгонат, капрат, лаурат, міристат, нонадеканоат) у плазмі крові всі значно знизили ожиріння (таблиці 4 та 5). Це спостереження відрізняється від спостереження, яке зазвичай повідомляється для дорослих. Ожиріння дорослих та діабет 2 типу, як правило, пов’язане зі збільшенням вмісту вільних жирних кислот у плазмі [27].

Біохімікати, ідентифіковані як потенційні біомаркери лише у плазмі крові (n = 64), відсортовані за здатністю ідентифікувати дітей із ожирінням (ожиріння p≤ 0,01). Відсік є B = як слина, так і плазма, P = лише плазма. Інші змінні - це ті, що описані в таблиці 2 легенди.

Біохімічні речовини плазми, які суттєво пов’язані з ожирінням (n = 64), наведені в таблиці 5.

Виходячи з межі значущості p≤0,01, у плазмі було 64 біохімічних речовин, які виявили дітей із ожирінням (табл. 4). Найчутливішими біомаркерами в плазмі були серин (0,79-кратне зниження) та серотонін (0,45-кратне зменшення), обидва з AUROC 0,84.

Найбільш значною зміною біохімічних речовин, пов'язаних із ожирінням у плазмі крові, було зниження рівня серотоніну (табл. 5) при ожирінні.

Гамма-глутамілфенілаланін збільшення при ожирінні передбачає збільшення активності гамма-глутамілтрансферази (GGT, E.C. 2.3.3.2). GGT давно використовується для оцінки захворювань печінки, а також пов'язаний з діабетом [28]. Третій за силою біохімічний, піперин є одним з алкалоїдів, який надає перцю їдкість.

Амінокислоти та похідні амінокислот були поширеними (n = 22) в біохімічних речовинах, які передбачають ожиріння. Три амінокислоти з розгалуженим ланцюгом (валін, ізолейцин, лейцин) та дві ароматичні амінокислоти (тирозин та фенілаланін) значно збільшився у плазмі крові дітей із ожирінням. Поздовжній аналіз дорослих у Фреймінгемському дослідженні серця [29] показав, що підвищений рівень цих п’яти амінокислот у плазмі стимулює вивільнення інсуліну та передбачає майбутній розвиток діабету за 12 років до початку діабету. Дві амінокислоти (серин та гліцин) значно знизився при ожирінні. Зниження рівня серину при ожирінні було найбільш сильно пов'язаною біохімічною зміною зразків плазми (р = 0,00001, AUC = 0,84)), про що також повідомляли інші дослідники [30].

Біохімікати, що становлять особливий інтерес

Обмеження цього дослідження включають метод нецільового метаболомічного аналізу. Цей метод не дає оцінки чутливості аналізу або абсолютних концентрацій для окремих біохімікатів, так що з цим аналізом завжди існує невідомий фактор. Це не обмеження мас-спектрометрії, а обмеження нецільового методу, який забезпечував лише відносну кількість 455 біохімікатів, але не мав абсолютних значень концентрації. Однак, виявивши підмножину 35 + 4 = 39 потенційно важливих біохімікалів слин, робить майбутній цілеспрямований аналіз перспективних біохімікатів більш доцільним шляхом усунення біохімікатів, які, як видається, не пов’язані з ожирінням.

Іншим обмеженням є проблема багаторазового аналізу. Тільки ті біохімікати, що мають значення р для ожиріння ≤ 0,01, були збережені в текстових таблицях. Оскільки виправлене Бонферроні значення р 0,05 для порівняння 455 дорівнює 0,0001, справжня статистична значимість мала місце лише для піпеколату (таблиця 2), фосфату та 3-4 гідроксифенілактату (таблиця 3) та серину (таблиця 5). Метою цього аналізу є виявлення тих біохімікатів у слині, які, швидше за все, пов'язані з ожирінням і найменш пов'язані з іншими загальними системними захворюваннями, а не для підтвердження можливості клінічної діагностики. Справжній аналіз діагностичного потенціалу вимагатиме цілеспрямованого підходу з набагато меншою кількістю біохімікатів, випробуваних у більшій когорті.

Висновки

Слина здатна надати значну інформацію щодо розвитку ожиріння у дітей. Однак, схоже, це не може бути пристосовано до оцінки багатьох жиророзчинних метаболітів у плазмі. Більшість метаболітів, що містяться лише в слині, імовірно походять від бактеріального обміну. Урат слини може бути корисним оцінювачем споживання фруктози та ризику метаболічного синдрому. Підвищений рівень креатиніну в слині та 2PY свідчать про можливе раннє захворювання нирок у дітей із ожирінням. Рівень плазми багатьох метаболітів у дітей із ожирінням (не діабетиками) відрізнявся в тому ж напрямку, що і дорослих із діабетом II типу. Нарешті, вміст фосфатів у слині може відображати розвиток дитячого ожиріння. Результати нашого нецільового метаболічного аналізу складають основу для подальших цілеспрямованих досліджень з точним визначенням ролі та регулювання виявлених факторів при ожирінні та метаболічних захворюваннях, загалом.