HGF покращує жирну печінку, спричинену дієтою

Анотація

Фактор росту гепатоцитів (HGF) надає різний вплив, особливо на клітини епітелію. Однак точна роль HGF у ліпогенезі досі не до кінця зрозуміла. Дієта з високим вмістом жиру вводилася трансгенним мишам HGF та контрольним мишам дикого типу in vivo. Крім того, рекомбінантний HGF людини (rhHGF) вводили клітинній лінії HepG2 in vitro. Ми провели аналіз факторів, що стосуються ліпідного обміну. Надмірна експресія HGF різко покращує жирну печінку, спричинену дієтою. Трансгенні миші HGF продемонстрували очевидно знижене накопичення ліпідів у печінці. Активація мікросомного білка переносу тригліцеридів (MTP) та аполіпопротеїну B (ApoB), що супроводжує більш високі рівні тригліцеридів у сироватці крові, була виявлена ​​у трансгенних мишей HGF на звичайній дієті. Цікаво, що це підвищення регуляції активації МТФ стало більш очевидним у дієті з високим вмістом жиру. Крім того, введення rhHGF стимулювало експресію MTP та ApoB, одночасно знижуючи знижений вміст внутрішньоклітинних ліпідів у клітинній лінії HepG2. Однак ця індукція MTP та ApoB за допомогою HGF була чітко пригнічена PD98059 (інгібітор MAPK). На закінчення дані, представлені в цьому дослідженні, показали, що HGF покращує жирову печінку, спричинену дієтою, завдяки активації MTP та ApoB.

спричинену

жирова печінка - поширене захворювання у пацієнтів, що супроводжується ожирінням та діабетом, і однією з основних причин розвитку ожиріння та діабету у людей є дієта з високим вмістом жиру.

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) зростає як стан, який з часом переростає в кінцеву стадію захворювання печінки. Патологічна картина нагадує картину алкогольної травми печінки, але вона спостерігається у пацієнтів, які не зловживають алкоголем. NAFLD вражає 10–24% загальної сукупності в різних країнах. Поширеність зростає до 57,5–74% серед людей із ожирінням (1).

Хоча пропонуються різні способи лікування цієї хвороби (7, 21), не доведено, що певні ліки безпосередньо покращують НАЖХП.

НАЖХП - це пошкодження печінки, при якому гістопатологічні відхилення імітують алкогольний стеатогепатит (19). Нещодавно було показано, що введення фактора росту гепатоцитів (HGF) покращує жирність печінки з алкоголем (28, 29), проте точний вплив HGF на НАЖХП ще потрібно з'ясувати. Тому ми дослідили, чи може введення HGF бути ефективним для поліпшення НАЖХП.

HGF - це поліпептид, який спочатку характеризувався як високопотужний мітоген гепатоцитів (10, 20). Недавні дослідження показали, що HGF є багатофункціональним цитокіном, який може викликати мітогенні, мотогенні та морфогенні реакції у різноманітних культивованих клітинах епітелію, що експресують трансмембранний рецептор тирозинкінази, c-Met (5, 38).

Ми розробили та підтримували трансгенну лінію HGF та розкрили кілька фенотипів (25, 30, 32). За допомогою цієї моделі миші ми дослідили вплив HGF на НАЖХП при дієті з високим вмістом жиру. Більше того, подальші дослідження привели до розуміння того, що поліпшення алкогольної травми печінки супроводжувалось регуляцією мікросомального білка переносу тригліцеридів (МТФ) та аполіпопротеїну В (АпоВ) (28, 29). Тому ми провели подальшу експертизу наступним чином, використовуючи MTP та ApoB у моделі NAFLD.

МТФ є обмежуючим швидкістю фактором для виробництва ApoB-вмісних ліпопротеїдів дуже низької щільності (12, 18, 37). МТФ - це ексклюзивний внутрішньоклітинний білок (12), і його основна роль полягає в перенесенні ліпідів на поліпептиди ApoB в ендоплазматичній сітці клітин, що секретують ліпопротеїни (12).

У цьому документі ми продемонстрували, що надмірна експресія HGF різко покращила жирну печінку, спричинену дієтою, з високим вмістом жиру in vivo. Крім того, ми показали, що цей захисний ефект HGF обумовлений активацією MTP та ApoB.

Трансгенні миші та лікування.

Трансгенні миші (Tg), у яких експресія кДНК мишачого HGF була зумовлена ​​промотором металотіоїну та областями контролю локусу, генерувались на генетичному тлі виродженого альбіноса FVB/NCr (далі - FVB), ​​як описано раніше (30) . Крім того, Takayama et al. продемонстрували, що трансген HGF експресується у всіх органах і існує ряд фенотипів, таких як гепатомегалія, кістозна хвороба, що супроводжується вогнищевим сегментарним гломерулосклерозом, виразки, пов'язані з хронічним активним запаленням прямої кишки тощо (25, 31–33).

Були використані шість-8-тижневі самці мишей дикого типу Tg та FVB (WT). Усі дослідження на тваринах проводились згідно з керівництвом з догляду та використання тварин, встановленим Інституційною комісією з огляду Вищої медичної школи університету Гунма. WT і Tg поміщали після відлучення (3 тижні) на дієту з високим вмістом жиру (60% калорій, отриманих з жиру; D12492, Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі), або на звичайну дієту чау (10% отриманих калорій з жиру; D12450B, Дієти дослідження). Мишей годували парами на цих дієтах протягом 4 тижнів.

Біохімічний та гістологічний аналіз.

Ліпіди екстрагували з 50 мг гомогенату печінки, і концентрацію ліпідів на вологу масу печінки вимірювали згідно з методикою, описаною раніше (9). Для гістологічного аналізу тканину печінки фіксували у 4% параформальдегіді та вбудовували у парафін. Альтернативно, печінкові ліпіди фарбували методом Oil Red O. Для аналізу білка або РНК зразки тканин заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 ° C до використання. Концентрації аланінамінотрансферази (АЛТ), тригліцеридів та глюкози в сироватці крові вимірювали за допомогою стандартного клінічного автоаналізатора (Hitachi 7170; Hitachi, Токіо, Японія). Рівень інсуліну в сироватці крові визначали за допомогою набору для радіоімуноаналізу інсуліну (Shionogi, Osaka, Japan) відповідно до інструкцій виробника. Рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою зразків, вилучених через 12 год голодування.

ApoB в сироватці крові або середовищі визначали за допомогою набору ApoB ELISA (ALerCHEK, Portland, ME) відповідно до інструкцій виробника.

РНК-аналіз.

Клітина гепатокарциноми людини, HepG2, була отримана з Американської колекції типових культур (Манассас, штат Вірджинія). Клітини HepG2 (2 × 105) висівали в 35-міліметровий посуд протягом 24 годин, середовище обмінювались безсироватковою DMEM (GIBCO BRL, Grand Island, NY), а потім клітини інкубували протягом ночі. Крім того, ці клітини інкубували протягом 6 год з 40 нг/мл рекомбінантного людського HGF (rhHGF; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота), з або без 20 мкМ інгібітора MAPK, PD98059 (Sigma-Aldrich Japan KK, Токіо, Японія), або інгібітор фосфатидилінозитол 3-кінази (PI3K), вортманінін (Sigma-Aldrich Japan KK), за 1 год до стимуляції HGF. Методи збору РНК, RT-PCR та ПЛР у реальному часі з використанням тканини або клітин печінки мишей були описані раніше (17). Деталі послідовності наведені в таблиці 1.

Таблиця 1. Послідовності пар праймерів, що використовуються для ампліфікації мРНК методом ПЛР у реальному часі

SREBP, білок, що зв’язує регулюючий елемент стеролу; G6PD, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.

Експерименти з мікрочипами.

Печінкова активність МТП.

Активність MTP печінки визначали за допомогою комерційного набору, заснованого на опосередкованому MTP перенесенні самозагашеного флуоресцентного нейтрального ліпіду з ядра донорської частинки в акцепторну частинку (Roar Biomedical, New York, NY).

Аналіз білка ApoB.

Для імунопреципітації 1000 мкг лізату тканини печінки інкубували з анти-ApoB антитілом (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) протягом 2 годин на льоду. Після додавання Gamma-Bind G Sepharose (Boehringer Mannheim, Mannheim, Німеччина) та промивання в буфері RIPA, імунопреципітати фракціонували на 10% поліакриламідних гелях (BIOCRAFT, Токіо, Японія). Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше (17).

Визначення вмісту внутрішньоклітинних ліпідів.

Клітини HepG2 інкубували в повному середовищі з 10% плодової бичачої сироватки в посуді діаметром 100 мм, вирощували до 70% злиття і витримували в безсироватковій DMEM протягом ночі. Клітини обробляли в безсироватковому середовищі протягом 24 годин з наступною інкубацією з або без 50 нг/мл rhHGF у середовищі протягом 24 годин. Вміст тригліцеридів визначали в клітинних лізатах за допомогою колориметричного аналізу і виражали у міліграмах ліпіду на міліграм клітинного білка, як описано раніше (36). Клітинні лізати гомогенізували і переносили супернатант, а потім змішували з хлороформом-метанолом і перемішували на вортексі. Після центрифугування нижній шар переносили і випаровували. Ми вимірювали вміст тригліцеридів після додавання 2-пропанолу (Wako Chemical, Осака, Японія).

Статистичний аналіз.

Всі дані були виражені як середні значення ± SD. Статистичний аналіз проводився неспареним студентом т-тест або односторонньою ANOVA. Коли застосовували аналізи ANOVA, відмінності середніх значень між групами досліджували за допомогою тесту багаторазового порівняння Фішера.

Вага тіла, метаболізм глюкози та рівень АЛТ у сироватці крові.

Хоча маса тіла як WT, так і Tg не відрізнялася, відносна маса печінки на масу тіла Tg була значно вищою, ніж маса WT при звичайній дієті (табл. 2). Споживання корму не відрізнялося як між дієтою, так і з групами мишей. Оскільки кажуть, що аномалії дії інсуліну можуть бути пов’язані з патогенезом НАЖХП, ми виміряли концентрацію глюкози та концентрації інсуліну в сироватці крові. Як результат, ці дані між обома групами мишей суттєво не відрізнялись (табл. 2). Більше того, дієта з високим вмістом жиру не впливала на рівень АЛАТ у сироватці крові у обох мишей (рис. 1A).

Рис. 1.A: рівень аланінамінотрансферази (АЛТ) у сироватці крові. B і C.: концентрація тригліцеридів у сироватці крові та печінки відповідно. Кожне значення представляє середнє значення ± SD (n = 6 на групу), *P і фарбують гематоксиліном та еозином (a-d) і олійно-червоний O (e і f). a, c, і e: WT. b, d, і f: Tg. Оригінальне збільшення × 400.

Таблиця 2. Вага тіла та печінки та метаболізм глюкози

WTTGP ЗначенняВага тіла, г.26,7 ± 1,727,4 ± 2,2росіяниВідносна маса печінки,%4,65 ± 0,126,40 ± 1,3

Таблиця 3. Експресія білка, пов’язаного з ліпідним обміном, у трансгенних мишей HGF

NC, без змін; Я, збільшення.

Експресія та активність гена MTP печінки.

Вираз МТР (рис. 2A) та активність МТР (рис. 2B) в Tg були вищими, ніж у WT при нормальній дієті з високим вмістом жиру. Крім того, дієта з високим вмістом жиру значно підвищувала експресію МТФ та активність МТФ у обох мишей.

Рис.2.A: експресія мРНК білка (MTP) мікросомального переносу тригліцеридів у печінці на нормальній жировій дієті або дієті з високим вмістом жиру. *P

Експресія печінкового гена ApoB та вміст білка ApoB.

У Tg експресія ApoB була значно вищою, ніж у WT (рис. 2C.). Однак дієта з високим вмістом жиру не прискорила вираз ApoB. Подібним чином вестерн-блоттінг показав, що рівень білка ApoB у печінці підвищується при Tg, а дієта з високим вмістом жиру не підвищує рівень білка ApoB в жодній з груп.

Вестерн-блот-аналіз показав, що білок ApoB збільшується в печінці Tg (рис. 2D). Концентрація Tg в сироватці крові була значно вищою, ніж концентрація WT при нормальній дієті з високим вмістом жиру (рис. 2Е).

Експресія та активність MTP та експресія та секреція ApoB, індуковані rhHGF у клітинній лінії HepG2.

Вираз МТР (рис. 3A) та активність (рис.3B) та вираз ApoB (рис. 3C.) та секреція (рис.3D) обидва суттєво зросли за рахунок стимуляції rhHGF. Всі ці ефекти суттєво гальмувались одночасним введенням rhHGF та PD98059, тоді як лише введення PD98059 не впливало на ці параметри (рис. 3, A-D). З іншого боку, лікування Вортманіном не блокувало жодного ефекту HGF (дані не наведені).

Рис.3.Вплив рекомбінантного фактора росту гепатоцитів людини (HGF) та PD98059 (PD) на MTP та ApoB у клітинах HepG2. A: ПЛР-аналіз в реальному часі мРНК MTP. B: Активність MTP. C.: ApoB. D: Вміст ApoB у культурних ЗМІ. Е: вміст внутрішньоклітинних ліпідів. Провулок 1, DMEM без сироватки (Ctrl.); доріжка 2, HGF 40 нг/мл; доріжка 3, HGF 40 нг/мл та PD98059 20 мкМ; провулок 4, PD98059 20 мкМ лише. Смужки помилок представляють стандартне відхилення триразових експериментів. Подібні результати були отримані в 3 незалежних експериментах. *P

Внутрішньоклітинний вміст тригліцеридів.

Додавання rhHGF до середовища викликало зменшення вмісту внутрішньоклітинних ліпідів (рис. 3Е). Крім того, попередня обробка PD95059, інгібітора MAPK, блокувала цей ефект rhHGF. Ці результати показали, що HGF прискорює секрецію ліпідів до зовнішньої клітини, і цей ефект, здавалося, діяв через шлях MAPK, принаймні частково.

У цьому дослідженні ми чітко продемонстрували, що надмірна експресія HGF різко покращує жирну печінку, спричинену дієтою, in vivo, а також механізм прискорення секреції ліпідів з печінки HGF.

У дослідженнях in vitro повідомлялося, що HGF регулює ліпідний обмін, такий як стимуляція синтезу ліпідів та секреція ліпопротеїнів (15, 16, 24, 26, 27). З іншого боку, в дослідженнях in vivo повідомлялося, що протидіабетичні реагенти піоглітазон та метформін покращують рівень алкогольної жирності печінки шляхом індукції експресії ApoB та активності МТФ через-зустрілися активація (3, 34). Більше того, Borowiak et al. (4) повідомили, що тривала втрата Met призводить до мікровезикулярного стеатозу в умовній мутації Met печінки мишей. Ми також продемонстрували, що у трансгенних мишей NK2 спостерігалося масивне внутрішньоклітинне накопичення ліпідів у гепатоцитах через 48 годин після часткової гепатектомії (22). Оскільки NK2 вважався антагоністом HGF різних видів біологічної діяльності (23), ці дві моделі мишей припускають, що сигналізація HGF-c-Met відіграє вирішальну роль у накопиченні ліпідів у печінці.

Вміст тригліцеридів у печінці модулюється кількома факторами, що впливають на синтез і окислення жирних кислот печінки та секрецію тригліцеридів із печінки (11). Профілі експресії генів, що регулюють окислення, синтез тригліцеридів або секрецію, наведені в таблиці 3. У цих генах не було відмінностей, окрім MTP та ApoB між WT і Tg. Крім того, ми також підтвердили рівні експресії репрезентативних генів за допомогою ПЛР у режимі реального часу (таблиця 1). В результаті серед багатьох генів, що регулюють окислення, синтез або секрецію тригліцеридів, експресія генів ApoB та MTP відрізнялася між WT та Tg. Крім того, ми детальніше вивчали ці гени на рівні РНК, білка та активності, як повідомлялося раніше (28, 29).

Вже було показано, що інгібуючий ефект на печінкову секрецію ліпопротеїдів дуже низької щільності був однією з основних причин алкогольної жирової печінки (6, 13, 35). Попереднє дослідження показало, що алкогольна жирова печінка супроводжується зниженням МТФ, а HGF покращує жирність печінки за рахунок нормалізації експресії МТФ (28, 29). У нашій системі експресія МТФ була збільшена більше на дієті з високим вмістом жиру, ніж на звичайній дієті (рис. 2A). Отже, HGF покращує жирову печінку незалежно від рівня експресії МТФ. Крім того, ми продемонстрували не тільки аналіз рівнів білка, пов'язаних із секрецією ліпідів, але також і те, що вміст внутрішньоклітинних ліпідів зменшувався внаслідок HGF. Однак для подальшого вивчення огляду HGF та ліпідного обміну буде потрібно подальше дослідження.

З іншого боку, дієта з високим вмістом жиру збільшувала мРНК МТР, але не мРНК ApoB. Оскільки ApoB контролюється посттрансляційно в процесі обміну речовин (2, 8), дієта з високим вмістом жиру не може прискорити експресію ApoB (рис. 2C.). Однак експресія ApoB у Tg була вищою, ніж у WT. Ці дані вказували на те, що HGF по-різному безпосередньо впливав на ApoB у рівні транскрипції завдяки дієті з високим вмістом жиру.

Оскільки вважається, що каскади Ras/MAPK та PI3K є двома основними шляхами сигналізації HGF/c-Met (39), ми досліджували передачу сигналів за допомогою інгібітора MAPK PD98059 та інгібітора PI3K вортманіну in vitro. Активація MTP та ApoB HGF була заблокована PD98059 не лише вортманіном (рис. 3). Цей результат показав, що сигналізація HGF/c-Met регулювала експресію MTP і ApoB через шлях MAPK, принаймні частково.

З іншого боку, повідомляється, що Tg має кілька фенотипів, таких як аномалії розвитку (30), ниркова дисфункція (31) та кишкові захворювання (33), а також гепатомегалія зі спонтанною неопластичною трансформацією (25, 32). Застосовуючи HGF для лікування жирової печінки в майбутньому, необхідно пильно звертати увагу на такі патологічні зміни, включаючи гепатокарциногенез.

На закінчення було встановлено, що HGF покращує жирову печінку, спричинену дієтою, одночасно викликаючи гіперліпідемію за рахунок прискорення системи секреції ліпідів, включаючи MTP та ApoB. Отже, HGF може бути потенційно ефективним засобом лікування НАЖХП; проте необхідні подальші дослідження, щоб з'ясувати, чи можуть гіперліпідемія або онкогенез (14) бути можливими побічними ефектами введення HGF.

СНОПКИ

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Тому стаття має бути позначена цим «реклама”Відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

Автори дякують доктору Гленну Мерліно (Національний інститут охорони здоров'я, Бетесда, доктор медичних наук) за надання трансгенного штаму HGF MH19 та Юку Накадзіма за допомогу в експериментах.