Гомеостаз вітаміну D порушений через посилену екскрецію з сечею 25-гідроксихолекальциферол-вітамін D-зв’язуючого білкового комплексу у цукерки цукера із цукровим діабетом

Департамент харчової науки та харчування людини

Міжвідомча вища програма з харчових наук, Університет штату Айова, Еймс, Айова

Департамент харчової науки та харчування людини

Міжвідомча вища програма з харчових наук, Університет штату Айова, Еймс, Айова

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: М. Дж. Роулінг, департамент харчової науки та харчування людей, Університет штату Айова, 220 Маккей-Холл, Еймс, IA 50011 ([електронна пошта захищена]).

Анотація

Оптимальний статус вітаміну d пов’язаний із поліпшенням довгострокових наслідків для здоров’я при серцево-судинних захворюваннях та раку, ускладненнях, що виникають із більшою частотою у осіб з неінсулінозалежним цукровим діабетом (NIDDM). Погана функція нирок, що також є наслідком погано контрольованого діабету 2 типу, призводить до гіпертонії, збільшення пошкодження епітеліальних клітин та збільшення ризику серцево-судинних захворювань (3, 11). На додаток до даних контрольних досліджень, які вказують на те, що підтримка оптимальних концентрацій 25-гідроксихолекальциферолу (25D3) у сироватці крові (> 90 нмоль/л) є профілактикою проти багатьох видів раку, дослідження показали, що оптимальний рівень вітаміну D може захищати від гіпертонії і пошкодження нефрону через придушення вироблення реніну в нирках (13, 36). Крім того, клінічні та епідеміологічні дослідження показали, що діабетики 2 типу та особи з хронічними захворюваннями нирок частіше потрапляють у те, що вважається неоптимальним діапазоном (

Рис. 1.Підтвердження інсулінонезалежного діабету (NIDDM) у цукерських цукрових щурів Цукера (ZDF). ZDF та нежирних щурів отримували у віці 6 тижнів та годували комерційною високоенергетичною дієтою для гризунів (дієта Purina Formulab 5008) для індукції діабетичного стану та евтаназували через 14 тижнів. Щоб підтвердити наявність діабету у щурів ZDF, глюкометр вимірювали глюкометром під час евтаназії. Інсулін у сироватці крові аналізували за допомогою ІФА, специфічного для інсуліну щурів. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6). ***P

Експресія гена мегаліну, кубіліну та Dab2.

Щоб визначити, чи втрата комплексу 25D3-DBP в сечі зумовлена зниженою нирковою абсорбцією, використовували цілі ниркові лізати для вимірювання експресії мегаліну, кубіліну та мРНК Dab2 за допомогою ПЛР у реальному часі. Ми виявили, що експресія як мегаліну, так і Dab2 була знижена у тварин із ZDF порівняно з худими контрольними тваринами (∼50 та ∼80% відповідно; Рис. 2 A і B), тоді як ми не виявили відмінностей у експресії мРНК кубіліну (дані не наведені). Подібним чином ми виявили, що імуногістохімічне фарбування зрізів тканин виявило, що експресія білка мегаліну та Dab2 знижена в проксимальних канальцях нирок у цих тварин (рис. 3). Більше того, з наших гістологічних спостережень за тканиною нирок у щурів ZDF, виявилося, що некроз присутній у проксимальних канальцях нирок, що може пояснити, принаймні частково, зменшене фарбування мегаліну та Dab2 у зрізах нирок.

Рис.2.Знижена експресія мегаліну та інвалідів-2 (Dab2) та ниркова реабсорбція білка, що зв’язує вітамін D (DBP), та альбуміну у щурів ZDF. Ниркову тканину та сечу збирали у тих самих тварин, як описано на рис. 1. A і B: мегалін та мРНК Dab2 аналізували, як описано в матеріалах та методах . A: кількість мРНК мегаліну (визначається ПЛР у реальному часі) у ZDF та худих щурів. B: Рядок мРНК Dab2 (визначається за допомогою ПЛР у реальному часі) у ZDF та худих щурів. C. і D: DBP сечі та альбумін аналізували, як описано в матеріалах та методах . A: концентрація DBP у сечі від ZDF та худих щурів. B: концентрація альбуміну в сечі від ZDF та худих щурів. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6). *P

Рис.3.Морфологія нирок та імуногістохімічний аналіз експресії мегаліну та Dab2 у нирках худих щурів та ZDF. Нирки висікали з тих самих тварин, як описано на рис. 1, обробляли та розрізали для фарбування гематоксиліном та еозином (Н & Е) для рутинної гістологічної оцінки (зверху) або піддають імуногістохімічному фарбуванню на мегалін і Dab2, як описано в матеріалах і методах. Мегалін- (середній) та Dab2-позитивні клітини (знизу) виглядають темно-коричневими на тлі синього гематоксилінового протікання.

Креатинін сироватки крові.

Функцію нирок оцінювали шляхом вимірювання рівня креатиніну в сироватці крові. Рівень креатиніну в сироватці крові був підвищений на 80% у тварин із ZDF порівняно з худими контролями, що вказує на те, що функція нирок порушена у тварин із ZDF (рис. 4).

Рис.4.Оцінка функції нирок у щурів ZDF. Сироватку, зібрану у тих самих тварин, як описано на рис. 1, використовували для вимірювання рівня креатиніну в сироватці крові. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6). *P

Альбумінурія та збільшення екскреції DBP у щурів ZDF.

Ми вимірювали альбумін у сечі для двох цілей. 1) альбумін, як і DBP, є відомим лігандом мегаліну (30), і 2) важка альбумінурія є біологічним маркером нефропатії (8, 30, 31). Ми виявили, що помітна альбумінурія була присутня у тварин ZDF, які виводили в 20 разів більшу кількість альбуміну порівняно з нежирними контрольними тваринами. Подібним чином, щури ZDF виводили велику кількість DBP із сечею (8,9 мкг/мл; рис. 2, C. і D). Навпаки, DBP був практично неможливим у сечі худого контрольного тварини, що вказує на те, що здатність тварин ZDF реабсорбувати комплекс 25D3-DBP була помітно порушена.

Концентрація 25D3 та 1,25D3 у сечі та сироватці крові.

Сечу досліджували на наявність 25D3 та 1,25D3, щоб визначити, чи пов’язана втрата DBP із сечею із збільшенням втрати вітаміну D. У сечі тварин із ZDF містилися підвищені концентрації загальної 25D3 (що залежить від DBP для транспортування до нирок), основного циркулюючого метаболіту вітаміну D, порівняно з нежирними контрольними тваринами (на 31% вище у тварин із ZDF при нормалізації до рівня креатиніну в сечі; рис. 5, B і D). Подібним чином, концентрація 1,25D3 у сечі (нормалізована до концентрації креатиніну в сечі) була більшою у тварин із ZDF порівняно з контрольними тваринами (рис.4).D). Крім того, концентрація DBP у сечі сильно корелювала з концентрацією 25D3 у сечі (рис. 6) у тварин ZDF (р 2 = 0,85, P

Рис.5.Концентрації 25-гідроксихолекальциферолу (25D3) та 1,25-дигідроксихолекальціферолу (1,25D3) у сироватці та сечі у нежирних щурів та ZDF. Сироватка та сеча, зібрані у тих же тварин, як описано на рис. 1, використовувались для вимірювання концентрацій 25D3 та 1,25D3 у худих щурів та ZDF методом ІФА, як описано у матеріалах та методах. . A: концентрація 25D3 у сироватці крові. B: концентрація 25D3 у сечі. C.: концентрація 1,25D3 у сироватці крові. D: концентрація 1,25D3 у сечі. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6). *P

Рис.6.Виділення DBP із сечею корелює з 25D3 із сечею у щурів ZDF. ZDF щури (n = 5) отримували у віці 6 тижнів і годували діабетогенною дієтою (Purina 5008) протягом 8 тижнів, поки не виявився діабет. Було зібрано 24-годинне виділення сечі, а рівні DBP та 25D3 у сечі оцінювали ELISA та EIA відповідно, як описано у матеріалах та методах. Результати кореляційного тесту Пірсона позначаються суцільною лінією (р = 0,921, P

Рис.7.Вживання холекальциферолу у худих щурів та ZDF. Щурів ZDF та їх худий контроль отримували у віці 6 тижнів та годували комерційною високоенергетичною дієтою для гризунів (дієта Purina Formulab 5008), поки їх не евтаназували у віці 14 тижнів. A: загальне споживання холекальциферолу у щурів ZDF та їх худий контроль протягом 8-тижневого періоду дослідження. B: споживання холекальциферолу, розраховане як МО · день –1 · кг маси тіла -1 за 8-тижневий період дослідження. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6). *P

Дослідження 2: Оцінка гомеостазу вітаміну D у щурів ZDF

Оцінка стану 25D3 та 1,25D3.

Рис.8.Збільшення виведення сечі та порушення компромісів у сироватці крові 25D3 та 1,25D3 у щурів ZDF. Одинадцятитижневих ZDF і нежирних контрольних щурів годували дієтою 0, 1000 або 10000 МО холекальциферолу/кг протягом 3 тижнів. Концентрації 25D3 та 1,25D3 вимірювали у сироватці та сечі, зібраній із ZDF та худих контрольних щурів методом ІФА, як описано у матеріалах та методах . A: концентрація 25D3 у сироватці крові. B: концентрація 25D3 у сечі. C.: концентрація 1,25D3 у сироватці крові. D: концентрація 1,25D3 у сечі. Дані виражаються як засоби (n = 8) ± SE; смужки з різними літерами суттєво відрізняються (P

Креатинін сироватки крові.

Як в дослідження 1, функцію нирок оцінювали шляхом вимірювання рівня креатиніну в сироватці крові. Рівень креатиніну в сироватці крові був підвищений на ~ 76% у тварин із ZDF порівняно з нежирним контролем (рис. 8D), що вказує на те, що функція нирок була порушена у тварин із ZDF.

Експресія альбуміну в сечі, DBP та ниркової експресії мегаліну у щурів ZDF.

Подібно до того, що ми спостерігали у нашому першому наборі експериментів, ми виявили сильну альбумінурію та втрату DBP у сечі у всіх тварин ZDF порівняно з їх худорлявим контролем (рис. 9, A і B). Концентрація альбуміну в сечі коливалась від 470 до 1250 мг/дл, а концентрація DBP у сечі становила від 2200 до 3500 серед усіх щурів ZDF, тоді як сечовий альбумін і DBP від худорлявих тварин практично не виявлялися. Більше того, як повідомлялося вище, зменшення експресії мегаліну ниркової мРНК спостерігали у всіх групах ZDF порівняно з їх худими аналогами (рис. 9C.).

Рис.9.Оцінка експресії мегаліну, ниркової реабсорбції DBP та альбуміну та функції нирок у щурів ZDF. Ниркову тканину та сечу збирали у тих самих тварин, як описано на рис. 7. Експресію мРНК ниркової мегаліну та концентрацію DBP та альбуміну в сечі визначали, як описано у матеріалах та методах . A: кількість мегалінової мРНК у нирках. B: концентрація DBP у сечі. C.: концентрація альбуміну в сечі. Дані виражаються як середні значення ± SE (n = 6); смужки з різними літерами суттєво відрізняються (P

CYP27B1, кальцій у сироватці крові та гормон паращитовидної залози.

Незважаючи на те, що у всіх щурів-діабетиків спостерігався знижений рівень сироватки 1,25D3, концентрація кальцію та паратиреоїдного гормону (ПТГ) у сироватці крові не відрізнялася між ZDF та худими тваринами в жодній із груп лікування (рис. 10, A і B). Експресія мРНК CYP27B1 у нирках була підвищена лише у тварин ZDF, які годувались дієтою VD, імовірно результатом зниження концентрації 1,25D3 у сироватці крові та/або відсутністю дієтичного холекальциферолу, як ми вже повідомляли раніше (28). Подібно до нашої раніше опублікованої роботи (28), зниження експресії мРНК CYP27B1 у нирках спостерігали, коли тварин ZDF годували дієтою VDS.

Рис.10.Вплив NIDDM на кальцій у сироватці крові, паратиреоїдний гормон у сироватці крові та на ниркову експресію CYP27B1. Вимірювали концентрацію кальцію та паратиреоїдного гормону в сироватці крові, а експресію ниркового CYP27B1 оцінювали методом ПЛР у реальному часі у тих самих тварин, як описано на рис. 7. A: кальцій у сироватці крові. B: сироватковий паратиреоїдний гормон. C.: ниркова експресія CYP27B1 у ZDF та худих контрольних щурів. Дані виражаються як засоби (n = 8) ± SE; смужки з різними літерами суттєво відрізняються (P

Взяті разом, наші дані настійно припускають, що основним механізмом, що сприяє порушенню статусу вітаміну D у нашій тваринній моделі NIDDM, була неадекватна мегалін- та/або Dab2-опосередкована реабсорбція нирок 25D3 та 1,25D3. Ці висновки узгоджуються з недавнім клінічним дослідженням, де дослідники виявили, що рівень мегаліну та кубіліну в сечі був помітно підвищений у хворих на альбумінур із діабетом 1 типу (30), що вказує на те, що в міру розвитку діабету здатність підтримувати нормальний вітамін D гомеостаз через опосередковані механізми порушено.

Підводячи підсумок, ці дослідження дали докази того, що мегалін-опосередкований ендоцитоз відіграє вирішальну роль у гомеостазі вітаміну D при NIDDM. У сукупності наші дані дають перші докази, принаймні наскільки нам відомо, що знижена реабсорбція нирки циркулюючого вітаміну D через порушений ендоцитоз, опосередкований рецепторами, є ключовим фактором, що сприяє неоптимальному статусу вітаміну D при NIDDM.

Ці дослідження стали можливими завдяки фінансуванню М. Дж. Роулінг від Центру досліджень харчування та оздоровлення Університету штату Айова/Спеціальний грант Міністерства сільського господарства США.

Автори повідомляють, що з цією статтею не існує подвійності інтересів.