Гіпертонія, спричинена дієтою, з високим вмістом жиру асоціюється з провоспалительним Т-клітинним профілем у самців і самок щурів Даля, чутливих до солі

Кафедра фізіології Університету Аугуста, Аугуста, Джорджія

Кафедра усної біології Університету Аугуста, Аугуста, Джорджія

Кафедра фізіології Університету Аугуста, Аугуста, Джорджія

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: J. C. Sullivan, 1459 Laney Walker Blvd., Augusta University, Augusta, GA 30912 (e-mail: [email protected]).

Анотація

НОВЕ І НОВЕ Наше дослідження демонструє, що у самців і самок щурів Даля, чутливих до солі, спостерігається подібне підвищення артеріального тиску до дієти з високим вмістом жиру та збільшення Т-клітин аорти та нирок. Ці результати на відміну від досліджень, що показують, що самки щурів залишаються нормотензивними та/або регулюють регуляторні Т-клітини у відповідь на гіпертонічні стимули в порівнянні з самцями щурів. Наші дані свідчать про те, що 4-тижнева дієта з високим вмістом жиру має специфічний для статі вплив на профіль Т-клітин у чутливих до солі щурів Даля.

Дві третини випадків гіпертонії в Сполучених Штатах позитивно корелюють із надмірним збільшенням ваги (22), а останні дані Національного обстеження здоров'я та обстеження вказують на те, що поширеність гіпертонії зростає із збільшенням індексу маси тіла (49). Дійсно, як у людей, так і у тваринних моделей гіпертонії такі дієтичні фактори, як насичені жири, холестерин та вуглеводи, мають значний вплив на контроль артеріального тиску (АТ) (21, 59, 71). Існують також дані, що підтверджують різницю в статі щодо впливу дієти з високим вмістом жиру (HFD) на серцево-судинні результати (33, 65), причому у самців експериментальних тварин спостерігається більший приріст АТ у відповідь на HFD порівняно з експериментальними тваринами (19 ). Хоча молекулярні механізми, що лежать в основі статевих відмінностей у відповіді АТ на ВЧС, до кінця не вивчені, зараз все більше визнається, що Т-клітини та прозапальні цитокіни відіграють важливу роль у прогресуванні гіпертонії на кількох моделях тварин (4, 15, 20, 29, 39, 41, 42, 67, 69, 76), включаючи щурів, чутливих до солі Даля (DSS) (12, 13, 15, 62).

Тварини.

У цьому дослідженні використовувались DSS чоловіків та жінок віком дванадцять тижнів (Envigo, Prattville, AL). Всі експерименти проводились відповідно до Національного інституту охорони здоров’я Посібник з догляду та використання лабораторних тварин і були схвалені та контролювались Інституційним комітетом з догляду та використання тварин університету Августи. Щурів утримували в приміщеннях, що регулюють температуру та вологість, і на циклі з легким вмістом жиру та утримували їх на нормальній жирній дієті (NFD; F4031, Bio-Serv, Flemington, NJ) або HFD (F3282, Bio-Serv) з 12 до 16 тижнів віку (період лікування 4 тижні). Контрольний NFD складався з 3,88 ккал/г валової енергії з калоріями з таких джерел: 20,5% білка, 61,6% вуглеводів та 7,2% жиру. HFD складався з 5,45 ккал/г валової енергії з калоріями з таких джерел: 20,5% білка, 35,7% вуглеводів і 36,0% жиру. Обидві дієти містять 0,8% NaCl. В кінці всіх експериментів щурам знеболювали кетамін-ксилазином (50 мг/кг та 6 мг/кг внутрішньочеревно, відповідно, Phoenix Pharmaceuticals, St. Joseph, MO), проводили торакотомію, кінцеву пробу крові отримували шляхом пункція аорти, і тканини збирали для проточного цитометричного аналізу Т-клітин та цитокінів.

Метаболічні параметри.

Аналітична проточна цитометрія.

Рис. 1.Стратегія стробової проточної цитометрії, що показує виділення одиничних клітин та виключення клітинного сміття на основі прямого розсіювання (FSC) та бічного розсіювання (SSC). Т-клітини аналізували на основі експресії CD3 та/або CD4. Загальні CD3 + Т-клітини були додатково заблоковані для експресії RAR-пов'язаних рецепторів-сиріт-γt для Т-клітин-хелперів 17, а CD3 + CD4 + Т-клітини додатково встановлені для експресії Foxp3 для регуляторних Т-клітин (Tregs).

Статистичний аналіз.

Всі дані представлені як середні значення ± SE. Дані проточної цитометрії та дані метаболічної клітини порівнювали за допомогою двосторонньої ANOVA. Телеметрію глюкози, манжету хвоста та масу тіла в кожній групі аналізували за допомогою повторних вимірювань ANOVA. Міжгрупові вимірювання проводились із використанням двостороннього ANOVA для манжети хвоста та маси тіла та т-тести для вимірювання глюкози. Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 6.0) (GraphPad Software, La Jolla, CA). Для всіх порівнянь відмінності вважалися статистично значущими з P

Таблиця 1. Дані про метаболічні клітини, включаючи масу тіла, споживання їжі, загальне споживання калорій, загальне споживання жиру, споживання води та виділення сечі у самців та самок щурів на NFD або HFD протягом 4 тижнів

Усі дані виражаються як середні значення ± SE; n = 5 самців щурів і 5 самок щурів. NFD, нормально-жирна дієта; Харчова дієта з високим вмістом жиру. Порівняння між групами проводили з використанням двостороннього ANOVA або двостороннього ANOVA з повторними вимірами між базовим та кінцевим показниками. Внутрішньогрупові порівняння проводились за допомогою тесту багаторазового порівняння Тукі та Сідака відповідно.

* P † P ‡ P

Рис.2.Рівень глюкози в крові постійно контролювався у чоловіків (n = 5) та жінки (n = 6) чутливі до солі щури Даля на дієті з високим вмістом жиру (HFD) від початкового рівня до кінця дослідження (A). Точкові вимірювання глюкози також періодично проводили протягом 4 тижнів HFD (B), а відсоток різниці точкових показань глюкози порівняно з показаннями телеметрії розраховували для визначення точності даних телеметрії (C.). Всі дані представлені як середні значення ± SE. Дані телеметрії глюкози та дані про плями глюкози в кожній групі аналізували за допомогою повторних вимірювань ANOVA; міжгрупові порівняння проводились за допомогою т-тести. Істотних відмінностей не було.

Самки DSS щурів демонструють індуковане HFD підвищення систолічного АТ через 4 тижні, подібно до самців щурів.

У багатьох генетичних та дієтичних моделях гіпертонії у самців щурів спостерігається більший приріст АТ, ніж у самок щурів (33, 65). Щоб визначити, чи існує різниця у статі у підвищеному HFD збільшення АТ у щурів DSS, систолічний АТ вимірювали на початковому рівні та в кінці дослідження у щурів на NFD та щотижня у самців та самок DSS щурів на HFD. 4-тижневий HFD привів до значного збільшення систолічного АТ як у самців, так і у самок щурів DSS порівняно з NFD (ефект дієти: P

Рис.3.Систолічний артеріальний тиск (АТ), виміряний через манжету хвоста у чоловіків (n = 5) та жінки (n = 5–6) чутливі до солі щури Даля, виражені як зміна (Δ) між початковим рівнем та після 4-тижневої нормальної жирної дієти (NFD) або дієти з високим вмістом жиру (HFD; A), виражене як абсолютні значення щотижня в групі, яка отримує HFD, і на початковому рівні, а також через 4 тижні в групі, яка отримує HFD (B) і виражається як відсоток збільшення від базового рівня (C.) в обох групах лікування. Одна самка щурів на NFD загинула до остаточного вимірювання АТ. Всі дані представлені як середні значення ± SE. Дані хвостової манжети в кожній групі аналізували за допомогою повторних вимірювань ANOVA. Δ та відсотки збільшення систолічного АТ порівнювали за допомогою двосторонньої ANOVA. +P

Як у самців, так і у самок DSS щури спостерігається збільшення відсотка CD4 + Т-клітин і провоспалительного фенотипу Т-клітин в аорті з периваскулярною жировою тканиною після HFD.

Початок гіпертонії супроводжується накопиченням Т-клітин та медіаторів запалення у судинній системі, зокрема в адвентиції та периваскулярному жирі (20, 29, 74). Щоб визначити, чи індуковані HFD збільшення АТ супроводжуються зміною профілю Т-клітин у судинній системі, проточний цитометричний аналіз проводили на грудній аорті з недоторканим прикріпленим жиром. Хоча 4-тижневий HFD не впливав на відсоток загальних CD3 + Т-клітин (ефект дієти: P = 0,95; взаємодія: P = 0,50; Рис.4A), HFD збільшив відсоток CD4 + Т-клітин в аорті порівняно з NFD незалежно від статі (ефект дієти: P = 0,0098; взаємодія: P = 0,38; Рис.4B). Більше того, відсоток загальних Т-клітин та CD4 + Т-клітин в аорті був порівнянним між статями (загальний Т-клітин, ефект статі: P = 0,50; CD4 + Т-клітини, ефект статі: P = 0,94).

Рис.4.Т-клітинний профіль в аортах з прилепленим жиром, інтактним 16-тижневого чоловіка (n = 4–6) та жінки (n = 6) чутливі до солі щури Даля, які отримували контрольну дієту з нормальним вмістом жиру (NFD) або дієту з високим вмістом жиру (HFD). Показані відсотки від загальної кількості Т-клітин (A), CD4 + Т-клітини (B), Регуляторні клітини Foxp3 + T (Tregs; C.), а також споріднений рецептор-сирота (ROR) γt + T хелпер (Th) 17 клітин (D), Клітини IL-17 + (Е) та клітини IL-10 + (F). Усі дані виражаються як середні значення ± SE. Дані проточної цитометрії порівнювали за допомогою двостороннього ANOVA.

Роль підмножин CD4 + Т-клітин, зокрема Tregs і Th17-клітин та їх відповідних цитокінів, була продемонстрована в патогенезі гіпертонії (37, 42, 66, 73). HFD зменшив відсоток протизапальних Tregs (ефект дієти: P = 0,036; взаємодія: P = 0,68; Рис.4C.) і збільшив відсоток клітин Th17 (ефект дієти: P = 0,0019; взаємодія: P = 0,98; Рис.4D), а також клітини IL-17 + (ефект дієти: P = 0,0019; взаємодія: P = 0,99; Рис.4F) незалежно від статі. HFD не впливав на відсоток клітин IL-10 + незалежно від статі (ефект дієти: P = 0,93; взаємодія: P = 0,43; Рис.4Е). Хоча самки щурів мали вищий відсоток трегів, ніж самці щурів (ефект статі: P = 0,0005; Рис.4C.), відсоток клітин аорти, які експресували протизапальний цитокін IL-10, був однаковим між статями (ефект статі: P = 0,66; Рис.4Е). На противагу цьому, самці щурів мали вищий відсоток клітин Th17, ніж самки щурів (ефект статі: P = 0,0026; Рис.4B); відповідно до висновку, більший відсоток клітин аорти експресував прозапальний цитокін IL-17 (ефект статі: P = 0,0014; Рис.4F).

У самців щурів DSS спостерігається більший індукований HFD відсоток прозапальної інфільтрації Т-клітин у нирках, ніж у самки щурів.

Нирка відіграє важливу роль у довгостроковій регуляції АТ, і було показано, що інфільтрація Т-клітин у нирці впливає на АТ на експериментальних моделях для чоловіків (28). Для визначення впливу статі та дієти на ниркову Т-клітинну інфільтрацію використовували аналітичну проточну цитометрію для вимірювання відсотка загальної кількості Т-клітин у самців та самок щурів DSS, яких годували NFD або HFD. 4-тижневий HFD призвів до збільшення відсотка загальних ниркових CD3 + Т-клітин у порівнянні з NFD у обох статей, хоча збільшення було більшим у самців щурів (ефект дієти: P = 0,0038; ефект сексу: P = 0,34; взаємодія: P = 0,041; Рис.5A). HFD також суттєво збільшив відсоток CD4 + Т-клітин як у самців, так і у самок щурів, і збільшення було порівнянним між статями (ефект дієти: P = 0,0064; ефект сексу: P = 0,30; взаємодія: P = 0,49; Рис.5B).

Рис.5.Т-клітинний профіль нирок 16-тижневого чоловіка (n = 4–6) та жінки (n = 6) чутливі до солі щури Даля, які отримували контрольну дієту з нормальним вмістом жиру (NFD) або дієту з високим вмістом жиру (HFD). Показані відсотки від загальної кількості Т-клітин (A), CD4 + Т-клітини (B), Регуляторні клітини Foxp3 + T (Tregs; C.), а також споріднений рецептор-сирота (ROR) γt + T хелпер (Th) 17 клітин (D), Клітини IL-17 + (Е) та клітини IL-10 + (F). Усі дані виражаються як середні значення ± SE. Дані проточної цитометрії порівнювали за допомогою двостороннього ANOVA.

HFD також призвів до зменшення відсотка імунодепресивних Tregs (ефект дієти: P = 0,0005; взаємодія: P = 0,091; Рис.5C.) і збільшення відсотка прозапальних клітин Th17 незалежно від статі порівняно з щурами, які підтримували НФД (ефект дієти: P = 0,014; взаємодія: P = 0,25; Рис.5D). Зниження відсотка Tregs не супроводжувалося будь-якими змінами в клітинах IL-10 + у відповідь на HFD у будь-якої статі (ефект дієти: P = 0,12; взаємодія: P = 0,11; Рис.5Е). Однак HFD дійсно збільшив відсоток клітин IL-17 + порівняно з NFD незалежно від статі (ефект дієти: P = 0,0004; взаємодія: P = 0,26, рис.5F). Самки DSS щурів мали більший відсоток імунодепресивних Tregs, ніж самці DSS щурів (ефект статі: P = 0,0054; Рис.5C.) і, як правило, мали більше клітин IL-10 +, хоча це не досягло статистичної значущості (ефект статі: P = 0,07; Рис.5Е). Хоча відсоток прозапальних клітин Th17 був порівнянним між статями (ефект статі: P = 0,19; Рис.5D), самці DSS щурів мали більший відсоток клітин IL-17 +, ніж самки DSS щурів (ефект статі: P = 0,021; Рис.5F).

Первинний новий висновок цього дослідження полягає в тому, що 4-тижневий HFD призводить до подібного збільшення систолічного АТ у самців і самок щурів DSS. Індуковане HFD підвищення АТ було пов’язане із збільшенням відсотка загальних Т-клітин у нирках, а також збільшенням відсотка ниркових та аортальних прозапальних клітин Th17; однак у самців щурів був більший відсоток ниркових клітин Th17 порівняно з самками щурів. HFD також зменшив відсоток аортальних Tregs, а самки щурів мали більший відсоток Tregs, ніж самці щурів, незалежно від дієти. Ці дані свідчать про те, що 4-тижневий HFD має головний вплив на активацію імунних клітин, що не залежить від статі. Виходячи з висновку, що збільшення АТ порівняно між статями, незважаючи на різницю в аортальному та нирковому Т-клітинних профілях, механізми, за допомогою яких HFD впливає на АТ, можуть бути різними між самцями та самками щурів. У майбутніх дослідженнях буде оцінено відносний внесок прозапальних клітин Th17 та протизапальних Tregs до гіпертензії, індукованої HFD, у самців та самок щурів DSS.

Збагачені жирами дієти зазвичай використовуються для імітації симптомів метаболічного синдрому, включаючи підвищене ожиріння, гіпертонію, дисліпідемію та порушення толерантності до глюкози у гризунів (7, 8). Однак реакція на ці метаболічні параметри може коливатися в широких межах залежно від штаму щурів та статі, а також від джерела харчового жиру (38). У цьому дослідженні ми виявили, що 4-тижневий збагачений свинячим жиром свинячий жир привів до більшого відсотка збільшення маси тіла відносно контрольного NFD як у самців, так і у самок щурів DSS, хоча це збільшення, як правило, було вищим у самців щурів DSS. Хоча протокол HFD і призвів до збільшення маси тіла відносно контрольного NFD у самців щурів, збільшення було відносно незначним. Однак, базуючись на знанні, що вісцеральний жир на відміну від підшкірного жиру збільшує ризик серцево-судинних захворювань (34), зміна розподілу жиру в організмі може мати значний вплив на результати серцево-судинної системи. Більше того, можливо, що зменшення енергетичних витрат сприяє збільшенню маси тіла у самців щурів DSS, оскільки споживання калорій залишається незмінним при HFD (15).

Швидка реакція АТ на HFD, особливо під час відносно короткого періоду лікування, видається унікальною для щурів DSS і може бути унікальною для щурів DSS від Envigo, що підтримується на HFD Bio-Serv. П’ятнадцять тижнів годування з високим вмістом жиру (45% жиру з ліпідів та 17% енергії з сахарози, D12451, Research Diets) мали незначний вплив на систолічний АТ у самців щурів Sprague-Dawley та Wistar (придбано в лабораторіях Harlan, Сантіга, Іспанія ) у порівнянні зі стандартною дієтою чау (43). Якщо лікування HFD (D12451, Дієти досліджень) подовжується до 32 тижнів; однак у самців щурів Спраг-Доулі (придбаних у Харлані, Індіанаполіс, штат Індонезія) спостерігається підвищення середнього артеріального тиску на 20 мм рт. ст. (11). Навпаки, у SHR, HFD (45% ккал від жиру) знижує АТ у самців щурів (61). Хоча в окремому дослідженні чоловічі SHR демонстрували значне збільшення систолічного АТ після 15 тижнів ВЧД (60% ккал від жиру, 211 ± 9 мм рт.ст.) порівняно з контрольною дієтою (175 ± 11 мм рт.ст.) (9), повідомлялося лише про кінцеві значення; тому немає ознак того, коли АТ почав зростати у цих тварин.

Хоча існує обмежена кількість даних про інфільтрацію Т-клітин у судині щурів DSS, було показано, що самці щурів DSS виявляють підвищену експресію запальних маркерів та медіаторів, а також інфільтрацію Т-клітин аорти CD8 + у порівнянні з нормотензивними контрольними щурами SSBN2 (73). . Крім того, індукована ангіотензином II гіпертонія призводить до накопичення Т-клітин на аорті, особливо в адвентиції та периваскулярному жирі самців мишей C57BL/6 (20, 29, 74). Відповідно до цих даних, у цьому дослідженні самці щурів DSS демонстрували значне збільшення систолічного АТ, коли їх поміщали на HFD із нормальною соллю протягом 4 тижнів, і це супроводжувалося підвищеним відсотком загальних ниркових Т-клітин, CD4 + Т-клітин аорти, і клітини Th17 в обох тканинах.

На відміну від того, що спостерігалося при прозапальних Т-клітинах, HFD зменшив відсоток аортальних та ниркових Tregs, хоча самки щурів мали більший відсоток Tregs, ніж самці щурів як у нирках, так і в аорті, незалежно від дієти. Це на відміну від інших досліджень, які продемонстрували компенсаторне збільшення рівня Tregs у самок у відповідь на гіпертонічні подразники, яких не спостерігалося у самців (54, 67, 69, 76). Це підвищує можливість дисфункції реакції Treg на HFD у самок щурів DSS, що може сприяти сприйнятливості до індукованого HFD збільшення АТ. Було показано, що прийомний перехід Tregs притупляє індуковану альдостероном гіпертензію (30), а також артеріальну гіпертензію, індуковану ангіотензином II, у мишей C57BL/6 (3, 37), підкреслюючи важливу антигіпертензивну роль цієї підмножини Т-клітин (3). Тому необхідні майбутні дослідження, щоб визначити, чи 1) Треги послаблюють підвищення АТ, спричинене HFD, як у самців, так і у самок щурів DSS 2) існує різниця у статі в антигіпертензивній здатності Tregs у відповідь на HFD.

Цю роботу фінансували Гранти Національного інституту серця, легенів та крові R0-HL-127091 та P01-HL-134604 (для Дж. Саллівана) та Грант Американської асоціації серця 17EIA33410565 (для Дж. Саллівана).