Межі у фармакології

Етнофармакологія

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Метаболоміка та метаболізм традиційної китайської медицини Переглянути всі 31 статтю

Редаговано
Хайтао Лу

Шанхайський університет Цзяо Тонг, Китай

Переглянуто
Рене Карденас

Національний автономний університет Мексики, Мексика

Сонсяо Сю

Artron BioResearch Inc., Канада

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

metabolomics

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Шеньчженьська ключова лабораторія підготовки лікарні китайської медицини, лікарня традиційної китайської медицини Шеньчжень, Шеньчжень, Китай
  • 2 Четвертий клінічний медичний коледж Гуанчжоуського університету китайської медицини, Шеньчжень, Китай

Китайський трав'яний відвар, таблетка Zishen Jiangtang (ZJP), клінічно призначається хворим на цукровий діабет для запобігання надмірного рівня цукру в крові протягом десятиліть. Однак потенційні механізми цієї дії не були добре досліджені. Метою цього дослідження було вивчення метаболічних змін у відповідь на лікування ZJP для тваринної моделі ожиріння діабету 2 типу. Для виявлення потенційних механізмів ZJP у діабетичних мишей було проведено засіб UHPLC-Orbitrap/MS на основі метаболоміки. Лікування ZJP значно відновило підвищений рівень інсуліну, глюкози та загального холестерину у дієтичних мишей з високим вмістом жиру. Всього в зразках сироватки було виявлено та ідентифіковано 26 потенційних біомаркерів, серед яких 24 метаболіти зазнали сильного впливу і були повернуті до контрольних рівнів після лікування ZJP. Проаналізувавши шляхи метаболізму, метаболізм глутатіону, біосинтез стероїдних гормонів та метаболізм гліцерофосфоліпідів були запропоновані тісно пов’язаними із захворюваннями діабету. З вищезазначених результатів можна зробити висновок, що ZJP виявляє перспективну протидіабетичну активність, в основному завдяки регуляції метаболізму фосфоліпідів, включаючи фосфатидилхоліни, лізофосфатидилхоліни та фосфатидилінозитол.

Вступ

Таблетки Zishen Jiangtang (ZJP), один із продуктів ТКМ, складаються з астрагалі-редіксу, Rehmanniae Radix Praeparata, Epimedii Folium, Notoginseng Radix et Rhizoma та інших трав. ZJP клінічно призначається пацієнтам із СД2 з хорошою ефективністю підтримувати рівень глюкози в крові протягом десятиліть, оскільки вважається, що він має ефективність тонізуючого ци та інь, живлячи нирки та кістки (Li et al., 2018). Попередні фармакологічні дослідження показали, що ZJP може зменшити концентрацію глюкози в крові у діабетичних щурів (Li et al., 2018). Однак основний механізм ZJP при діабеті менш відомий.

Протягом останнього десятиліття метаболоміка прагне розробити систематичний аналіз усіх метаболітів малих молекул і успішно застосовується для розшифровки молекулярних механізмів ТКМ (Cao et al., 2015; Li et al., 2017; Wang et al., 2017) . Метаболоміка - це цілісне профілювання метаболітів малих молекул, що пропонує знімок фізіологічних процесів. Цілісний погляд, який застосовується метаболомікою, подібний до погляду ТКМ, що дозволяє глибоко дослідити ТКМ зі складними умовами та багатьма факторами (Wang et al., 2015). Останній розвиток технологій мас-спектрометрії забезпечує аналітичну платформу для розуміння патофізіології діабету та його ускладнень (Sas et al., 2015).

Тут, у нашому поточному дослідженні, ми використовували інструменти метаболоміки для дослідження ролі ZJP у діабетичних мишей типу 2, індукованих дієтою з високим вмістом жиру, та її потенційний механізм. Розроблено підхід UHPLC-Orbitrap/MS до метаболоміки для виявлення метаболічних профілів моделі T2DM та нормальних мишей, а також пройшли скринінг потенційних біомаркерів для T2DM. Потім також аналізували вплив ZJP на ці біомаркери та відповідний шлях метаболізму.

Матеріали і методи

Хімічна речовина та реагент

Таблиця 1. Склад і частка трави в ZJP.

Індукція експериментального цукрового діабету у мишей

Шеститижневих самців мишей C57BL/6 придбали у Нанкінському університеті-Нанкінській біофармацевтичній установі. Експериментальних тварин утримували у спеціальному приміщенні для тварин, що не має патогенів (SPF), протягом 12 годин циклу світло-темно, з їжею та водою ad libitum. Це дослідження було проведено відповідно до рекомендацій Національного інституту охорони здоров'я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Усі процедури на тваринах проводились із схвалення протоколу Комітету з етики лікарні традиційної китайської медицини Шанчжоу, Університет китайської медицини Гуанчжоу (Шеньчжень, Китай), і всі зусилля були зроблені для мінімізації страждань тварин.

Мишам забезпечували або звичайну дієту, або дієту з високим вмістом жиру протягом 12 тижнів. Контрольну групу годували нормальним харчуванням (код LAD3001M, Nantong Trofee Feed Technology Co., Ltd.). Експериментальна дієта являла собою модифіковану модель, засновану на дієті з модельного ожиріння серії Van Heek (Код TP23400, Nantong Trofee Feed Technology Co., Ltd.), і корм виготовляли відповідно до стандарту AIN93. Приблизно через 12 тижнів моделювання мишей з високим вмістом жиру ділили випадковим чином на 4 групи (n = 10 на групу): Група 1: модельна група (лише дієта з високим вмістом жиру); Група 2: Дельтамінова група (168 мг/кг/добу); Група 3: висока доза таблеток Zishen Jiangtang (H-ZJP) (1,51 г/кг/добу); Група 4: низькі дози групи таблеток Zishen Jiangtang (L-ZJP) (0,75 г/кг/добу). Той же обсяг дистильованої води давали контрольній та модельній групам. Після 8 тижнів лікування мишей забивали. Зразки крові відбирали з ретроорбітальних вен.

Біохімічний аналіз

Імуногістохімічний аналіз

Тканини острівців у мишей відбирали, фіксували 4% нейтральним параформальдегідом, виготовляли парафінові зрізи розміром 4 мкм після зневоднення, вкладання воску та нарізки. Зрізи інкубували зі специфічними первинними антитілами, спрямованими проти інсуліну (Cat No. ab8304, Abcam) та глюкагону (Cat No. ab36598, Abcam), відповідно. Згодом зрізи інкубували з кон’югованими HRP вторинними антитілами (Cat NO. KIT-9901, MXB Biotechnologies) та візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа (Olympus, Японія).

Підготовка зразка для LC-MS аналізу

Зразки сироватки розморожували при кімнатній температурі, і 100 мкл яких додавали 300 мкл крижаного ацетонітрилу. Розчин ретельно перемішували вихором протягом 30 с, витримували при 4 ° С протягом 10 хв, потім центрифугували (12000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° С). Супернатант (250 мкл) переносили і додавали 20 мкл IS (2-хлор-L-фенілаланін, 1 мг/мл), потім упарювали насухо під газом азоту при 37 ° С. Залишок повторно розчиняли зі 100 мкл 10% ацетонітрилу і центрифугували (13000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° C) після вихрового переміщення протягом 60 с. Супернатант переносили у флакони з автоматичним відбором проб для подальшого аналізу UHPLC-Orbitrap/MS.

Перевірка методу

Щоб гарантувати якість нецільових біоаналітичних даних, для перевірки методу використовували зразки контролю якості (QC). Тут 20 мкл зразків сироватки з кожної групи об'єднували для отримання зразка контролю якості, а зразки контролю якості витягували за допомогою методу вилучення зразків, згаданого вище. Зразки QC аналізували кожні шість зразків протягом усієї процедури аналізу. Повторюваність і стабільність проводили шляхом підготовки та аналізу шести зразків контролю якості.

Хроматографічне розділення проводили на системі Dionex UltiMate 3000 UHPLC (Thermo Scientific, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Колонку Waters Acquity BEH C18 (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters, Мілфорд, США) застосовували для всіх аналізів при 30 ° C. Рухлива фаза складалася з 0,1% води мурашиної кислоти (A) та ацетонітрилу (B) зі швидкістю потоку 0,2 мл/хв. Об'єм ін'єкції встановлювали як 2 мкл. Для аналізу позитивного режиму умови градієнта були такими: 0–4 хв 10–13% В; 4–6 хв 13–50% В; 6–10 хв 50% В; 10–14 хв 50–85% В; 14–18 хв 85% В; 18–20 хв 85–100%; 20–25 хв 100%; повторна рівновага: 10 хв. Для аналізу негативного режиму умови градієнта були такими: 0–2 хв 15% В; 2–4 хв. 15–55% В; 4–8 хв 55% В; 8–14 хв 55–70% В; 14–22 хв 70–80% В; 22–24 хв 80–100%; 24–28 хв 100%; повторна рівновага: 10 хв.

Експерименти з масової спектрометрії проводили на мас-спектрометрі орбітрапу (LTQ ORBITRAP VELOS PRO, Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Каліфорнія, США), оснащеному джерелом електророзпилювальної іонізації (ESI) як в позитивному, так і в негативному режимі. Діапазон сканування становив від 100 до 1500. Параметри MS: температура іонізації електророзпилювача (° C): 350 (ESI +)/350 (ESI -); Швидкість потоку газу в оболонці (arb): 35 (ESI +)/35 (ESI -); Допоміжний витрата газу: (arb): 10 (ESI +)/10 (ESI -); Швидкість потоку газу (arb): 0 (ESI +)/0 (ESI -); I Напруга розпилення (кВ): 3,2 (ESI +) /3,2 (ESI -); Температура капілярів (° C): 300 (ESI +)/300 (ESI -).

Обробка даних

Файли необроблених даних були попередньо оброблені, процедури включали пошук піків, вирівнювання, фільтрацію та нормалізацію до загальної площі, тривимірний набір даних складався з інформації про вибірки, інтенсивності піків, часу збереження піку (RT) та відношення маси до заряду (м/z) було отримано. Час утримання та дані m/z використовувались для ідентифікації кожного іона. Більше того, піки з відсутнім значенням (інтенсивність іонів = 0) у більш ніж 80% зразків були видалені, щоб отримати узгоджені змінні. Потім отримані матриці даних були імпортовані в програмне забезпечення SIMCA14.1 (Umetrics, Умео, Швеція) для багатовимірного статистичного аналізу. Для аналізу метаболітного профілю використовувались методи аналізу, що містять аналіз основних компонентів (PCA), частковий дискримінантний аналіз найменших квадратів (PLS-DA) та ортогональний дискримінантний частковий аналіз найменших квадратів (OPLS-DA) (Chang et al., 2017).

Ідентифікація біомаркера та аналіз шляхів метаболізму

Модель ортогонального часткового дискримінантного аналізу найменших квадратів проводили для візуалізації метаболічної різниці між модельною групою та контрольною групою. Ці змінні з VIP> 1 у моделі OPLS-DA, а також змінні з p | corr | значення> 0,58 на S-ділянці, а змінні з довірчим інтервалом перетнули нуль на ділянці навантажувального ножа розглядали як потенційні біомаркери. Потенційні біомаркери були виявлені за допомогою Masslynx (Waters Technologies, США) у поєднанні з базою даних METLIN 1 та базою даних HMDB 2. Потім були застосовані криві робочої характеристики приймача (ROC) (SPSS 19.0) для аналізу даних для оцінки прогностичної потужності ідентифікованих біомаркерів. Аналіз шляху залежав від бази даних KEGG 3, MetaboAnalyst 3.0 4 .

Статистичний аналіз

Індивідуальні дані виражали як Середнє ± стандартне відхилення (SD). Статистичний аналіз проводили за допомогою одностороннього ANOVA (версія 13.0, SPSS). Статистично значущі зміни класифікували як суттєві (*) де p ∗∗) де p ∗∗∗) де стор ∗∗ P # P ## P −4% –1,0 × 10 −4% для масової точності (додаткові таблиці S1, S2).

Малюнок 3. Графіки балів з моделі PCA та OPLS-DA на основі метаболічного профілювання. (A) Графік результатів PCA-X позитивного іонного режиму. (B) Графік результатів PCA-X негативного іонного режиму. (C) Графічний показник OPLS-DA позитивного режиму іонів. (D) Графік оцінок OPLS-DA негативного іонного режиму. ESI + означає позитивну іонізацію електророзпиленням. ESI - означає негативну іонізацію електророзпиленням. Сині крапки представляють контрольну групу, зелені крапки представляють групу моделей.

Метаболічні профілі UHPLC-Orbitrap/MS нормальних та діабетичних мишей

За допомогою розробленого методу UHPLC-Orbitrap/MS загалом було виявлено 8000/8000 піків (ESI +/ESI -) у зразках сироватки. Вектори даних з контрольної та модельної груп були зібрані як матриця для аналізу PCA та OPLS-DA для виявлення потенційних варіацій. Графічні показники PCA продемонстрували чітке розділення між контрольною та модельною групами в метаболічних профілях (Фігури 3A, B). Подібні висновки були знайдені в бальних графіках OPLS-DA (малюнки 3C, D). Для аналізу OPLS-DA модель показала чудову класифікацію та прогностичну здатність між контрольною та модельною групами з перехопленням R 2 Y вище 0,99 та Питання 2 вище 0,85 (рис.3).

Потенційні біомаркери для діабету з високим вмістом жиру

У зразках плазми було виявлено та ідентифіковано 26 потенційних біомаркерів (табл. 2). Аналіз кривої ROC продемонстрував детальну область під кривою (AUC), стор-значення, 95% довірчий інтервал та значення помилки 26 виявлених потенційних біомаркерів для прогнозування діабету (рис. 4). 26 метаболітів показали відмінні діагностичні властивості із середньою площею під кривою 0,78–1,00 та стор-значення при 0–0,034. Тут дані вказували на те, що виявлені біомаркери мали потужну діагностичну здатність.

Таблиця 2. Тотожність диференціальних метаболітів між контролем та моделлю.

Малюнок 4. ROC-аналіз 26 потенційних біомаркерів із сироватки крові у мишей з діабетом. Детальна площа під кривою (AUC), стор-значення, 95% -ний довірчий інтервал та значення помилки 26 виявлених потенційних біомаркерів вказані на кривій ROC. 26 регульованих метаболітів забезпечували хороші діагностичні здібності із середньою площею під кривою 0,78–1,00 та стор-значення при 0–0,034.

ZJP викликає метаболічні зміни експериментальних мишей

Для того, щоб виявити корисну роль ZJP у лікуванні діабету, було проведено аналіз PLS-DA для отримання змін метаболічної траєкторії після медикаментозного лікування. Як показано на малюнку 5, метаболічна траєкторія модельної групи поступово рухалась до контрольної групи після введення ZJP або дельтаміну. Більше того, відносні кількості 26 потенційних метаболітів були отримані з використанням пікової інтенсивності з отриманих матриць даних, серед яких 24 метаболіти були сильно вплинуті ZJP порівняно з модельною групою (рис. 6). Тут оброблені ZJP миші відновлювались до нормальних рівнів, змінених дієтою з високим вмістом жиру, яка включала знижену регуляцію біомаркерів.

Малюнок 5. Вплив ZJP на метаболічний профіль за графіками PLS-DA. Графік результатів PLS-DA позитивного іонного режиму (A) і негативний іонний режим (B) для контрольної, модельної та обробленої груп.

Малюнок 6. Відносний вміст 26 метаболітів. Метаболіти були виявлені у зразку сироватки. Дані представлені як середні значення ± SD (n ≥ 8, ∗ P ∗∗ P ## P Ключові слова: фітотерапія, діабет 2 типу, метаболоміка, потенційні біомаркери, метаболічні шляхи

Цитування: Chen J, Zheng L, Hu Z, Wang F, Huang S, Li Z, Zheng P, Zhang S, Yi T and Li H (2019). Індукований дієтою цукровий діабет 2 типу у мишей. Спереду. Фармакол. 10: 256. doi: 10.3389/fphar.2019.00256

Отримано: 08 серпня 2018 р .; Прийнято: 28 лютого 2019 р .;
Опубліковано: 19 березня 2019 р.

Хайтао Лу, Шанхайський університет Цзяо Тонг, Китай

Рене Карденас, Національний автономний університет Мексики, Мексика
Сонгсяо Сю, Artron BioResearch Inc., Канада

* Листування: Jianping Chen, [email protected] Huilin Li, [email protected]