Ексенатид захищає від індукованої глюкозою та ліпідами ендотеліальної дисфункції: докази прямого вазодилатаційного ефекту агоністів рецепторів GLP-1 у людей

Анотація

Вступ

Ендотеліальна дисфункція відіграє вирішальну роль у розвитку атеросклерозу та серцево-судинних подій (1–3). Він присутній при цукровому діабеті 2 типу (4,5) і пов’язаний із концентрацією глюкози та тригліцеридів у крові після їжі (6–8). Як постпрандіальна гіперглікемія, так і гіпертригліцеридемія покращуються агоністами рецепторів GLP-1 (GLP-1R) (9–13), вказуючи на потенціал цих ліків від діабету для покращення функції ендотелію (ЕФ).

індукованої

У нашому попередньому дослідженні одна ін’єкція екзенатиду агоністу GLP-1R пригнічувала підвищення концентрації глюкози та тригліцеридів після їжі та покращення EF після одноразового прийому їжі з високим вмістом жиру у пацієнтів із порушеннями толерантності до глюкози (IGT) та нещодавно діагностованого, контрольованого дієтою типу 2 діабет (14). Хоча поліпшення ЕФ було подібним у пацієнтів з ІГТ та діабетом, закономірність зміни ФВ виявилася різною, і в той час як пацієнти з ІГТ продемонстрували абсолютне збільшення постпрандіальної вазодилатації ексенатидом, у пацієнтів з діабетом спостерігалося покращення зниженого ЕФ, спричиненого їжею . Чи може ексенатид покращити ЕФ у пацієнтів з діабетом 2 типу протягом наступних прийомів їжі та чи будуть ці судинні переваги у пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу тривалішої та, можливо, більшої судинної дисфункції, багато в чому.

Хоча ми виявили, що частина ефекту екзенатиду на ЕФ пояснюється зниженням концентрації тригліцеридів у плазмі крові (14), деяке покращення ЕФ, викликане ексенатидом, не залежить від зниження рівня глюкози та тригліцеридів у плазмі, підтримуючи концепцію прямого, ендотелій-залежне вазорелаксація агоністами GLP-1R (15–24). Пряма судинна дія агоніста GLP-1R може включати кілька механізмів. Тоді як попередні дослідження на гризунах припускали роль не опосередкованого GLP-1R шляху, що активується головним чином продуктами розпаду GLP-1 (19,20), більш пізні дані in vitro та in vivo вказують на пряму дію через ендотеліальні GLP-1R ( 22,24). На підтвердження останнього, кілька кіназних шляхів, відомих для активації ендотеліальної оксиду азоту (NO) -синтази (eNOS) та збільшення вироблення NO, in vitro регулюються різними агоністами GLP-1R (25–28). Однак, який із цих специфічних пострецепторних шляхів може врахувати вплив ексенатиду на ЕФ у людини, залишається в основному невідомим.

Для роз’яснення цих питань ми вивчали 1) чи має ексенатид сприятливий вплив на ЕФ під час послідовних прийомів їжі при цукровому діабеті 2 типу, 2) чи виникають ці ефекти у пацієнтів із більш усталеним діабетом 2 типу, та 3) якою мірою можуть бути ефекти ексенатиду пояснюється безпосередньою дією ексенатиду через GLP-1R. Крім того, ми досліджували молекулярні шляхи, відповідальні за дію агоніста GLP-1R, використовуючи артеріоли людини та ендотеліальні клітини.

Дизайн та методи дослідження

Два рандомізованих подвійних сліпих перехресних дослідження були схвалені комісією з огляду інституцій. Усі суб'єкти надавали інформовану згоду до участі. Пацієнти в обох дослідженнях отримували стабільні дози артеріального тиску та ліпідознижуючі препарати протягом 3 місяців до зарахування.

Дослідження 1

Дослідження 2

Учасники з IGT або нещодавно діагностованим (am. Після базового вимірювання ЕФ катетери розміщували відповідно в антекубітальній вені (для вливання ліків) та дорсальній вені кисті (для забору крові) домінуючої та недомінантної руки. Шістдесят хвилин після базового вимірювання ЕФ, розпочато грунтовану (6000 пмоль/л/кг) безперервну (600 пмоль/л/кг ⋅ хв) інфузію екзендіну-9 (Бахем, Бюбендорф, Швейцарія) або еквівалентного об'єму фізіологічного розчину. Через тридцять хвилин після цього внутрішньовенна інфузія було введено екзенатид (50 нг/хв) або еквівалентний об’єм плацебо. Показано, що така швидкість інфузії ексенатиду забезпечує швидку та стабільну концентрацію, подібну піковій концентрації після типових підшкірних ін’єкцій ексенатиду (30). спеціальний фармацевт для забезпечення того, щоб дослідний персонал залишався засліпленим. Вимірювання ЕФ повторювали через 30 хв під час інфузії ексенатиду/плацебо. Внутрішньовенне застосування екзендіну-9 та ексенатиду було схвалено в США Управління з контролю за продуктами та ліками IND 108.117 (J.K.). Зразки крові для вимірювання глюкози та інсуліну відбирали перед кожним кроком інфузії та за 10 хв до другого вимірювання ЕФ, після чого лінію забору крові відбирали, щоб уникнути можливих перешкод у вимірюванні ЕФ.

Вимірювання EF

EF оцінювали за допомогою периферичної артеріальної тонометрії (PAT) (ENDO-PAT2000; Itamar Medical, Кесарія, Ізраїль), як було детально описано раніше (14). Безперервні пульсуючі реакції об’єму крові обох вказівних пальців реєстрували протягом 5-хвилинного періоду врівноваження, 5-хвилинного періоду, включаючи супрасистолічне роздування манжети артеріального тиску на недомінантній руці, та 5-хвилинного періоду після інфляції. Значення індексу реактивної гіперемії (РЗІ) нормалізували на показники з контралатеральної групи. Середній внутрішньопредметний коефіцієнт варіації вимірювання RHI у нашій лабораторії становить 3% того самого дня послідовно та 10% у два окремі дні.

Дослідження ендотеліальних клітин

Ендотеліальні клітини аорти людини (HAEC) та ендотеліальні клітини пуповинної вени (HUVEC) (Lonza; CC-2535 та CC-2517, відповідно, Walkersville, MD) підтримувались в ендотеліальному базальному середовищі (CC-3162; Lonza) з доповненим ростом коефіцієнтів при 37 ° С у зволоженому інкубаторі, доповненому 5% СО2.

Пасаж 6–8 HAEC при 90–95% злиття обробляли екзендіном-4 (тобто ексенатидом) з попередньою обробкою або без неї сполукою-С інгібітора AMPK (СС) або екзендіном-9 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) промивають PBS і лізують відповідними інгібіторами фосфатази та протеази. Загальний і фосфорильований AMPKα (сайт фосфорилювання Thr172), cAMP-залежну протеїнкіназу (PKA, Thr197), Akt-кіназу (Ser473) та eNOS (Ser1177) вимірювали за допомогою Вестерн-блот, використовуючи антитіла від Cell Signaling Technology (Beverly, MA) і нормалізується до α-тубуліну.

AMPKα1-специфічні малі заважаючі РНК (siРНК) (TriFECTa Kit; IDT Inc., Coralville, IA) або контрольні siRNA (IDT Inc.) були використані для вивчення того, чи AMPK опосередковує ефекти виробництва NO. HUVEC використовували для полегшення трансфекції з використанням реагенту для трансфекції HiPerFect (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія). Пасаж 3–5 клітин при з’єднанні 75–80% трансфікували протягом 24 годин міРНК анти-AMPKα1 або контрольну міРНК перед обробкою 10 нмоль/л екзендіну-4.

NO вимірювали за допомогою 4,5-діамінофлуоресцеїн-діацетату (DAF-2DA; Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA). HAEC та HUVEC, які досягли злиття 80% на 24-лункових планшетах, інкубували з 5 мкмоль/л DAF-2DA протягом 15 хв до завершення відповідної обробки, промивали PBS (pH 7) і фіксували в 4 % параформальдегіду. Пластини були зображені на EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY), а інтенсивність флуоресценції NO аналізували за допомогою ImageJ.

Дослідження вазореактивності

Лабораторні дослідження

Концентрацію глюкози в плазмі крові вимірювали біля ліжок за допомогою аналізатора глюкози YSI 2700D (Yellow Springs, OH). Зразки для інших вимірювань у плазмі або сироватці зберігали при -80 ° C до аналізу на вміст ліпідів у плазмі (Еббот, Лейк-Форест, Іллінойс), інсуліну в плазмі (EMD Millipore), аполіпопротеїну B48 (apoB48; Biovendor, Asheville, NC) та ацетамінофену ( Імуналіз, Помона, Каліфорнія) та концентрації d-ксилози (34).

Статистичний аналіз

Потік учасників для досліджень 1 (A) та 2 (B).

Вихідні клінічні характеристики учасників, які закінчують дослідження 1 і 2

Дослідження 1

Тридцять шість випробовуваних завершили обидві групи лікування, одна відмовилася від прийому плацебо, а п’ять - під час прийому екзенатиду (рис. 1А). Двоє пацієнтів мали нудоту з 10 мкг ексенатиду і завершили дослідження на 5 мкг ексенатиду. Клінічні характеристики не відрізнялися між підгрупами тривалості діабету (табл. 1). Лікування ексенатидом супроводжувалось помірним зниженням маси тіла, систолічного артеріального тиску, глюкози натще, загальної концентрації холестерину та ЛПВЩ (табл. 2). Усі учасники споживали всю пробну їжу. Реакції на глюкозу та інсулін після сніданку були нижчими, а реакції на інсулін після обіду - вищими після ексенатиду (рис. 2А та Б). Екскурсії тригліцеридів та апоВ48 після їжі помітно зменшились після ексенатиду (рис. 2С і D). Концентрації ацетамінофену продемонстрували значну взаємодію між лікуванням та часом, спостерігаючи тенденцію до зниження через 2 години після сніданку після ексенатиду (P = 0,01), тоді як концентрації d-ксилози після обіду не відрізнялися між лікуваннями (додаткова фіг. 1).

Клінічні характеристики та концентрація кількох метаболічних змінних у крові натще після 10 днів лікування екзенатидом та плацебо у 36 пацієнтів, які завершили перехресне дослідження 1

Вплив ексенатиду на концентрацію глюкози (A), інсуліну (B), тригліцеридів (C) та апоВ48 (D) у дослідженні 1. На 11 день терапії, безпосередньо після первинного забору крові (час 0), досліджуваний препарат був вводили і учасники вживали сніданок (BF) і через 4 години обід (L). Дані є середніми ± SE. † P 0,5 обидва).

Обговорення

У нашому попередньому дослідженні одна доза екзенатиду сприятливо впливала як на рівень ліпідів після їжі, так і на рівень ЕФ у учасників з ІГТ або діабетом, що почався вперше. Однак кілька ключових питань залишились без відповіді. Наприклад, не було ясно, чи негликемічні переваги ексенатиду будуть виходити за рамки однієї гострої дози. У цьому дослідженні на це чітко відповіли ствердно, оскільки подібні сильні зміни концентрацій тригліцеридів та ФВ відбулися після більш хронічного застосування ексенатиду в дослідженні 1. Хоча помірне зниження ваги мало місце при тривалому застосуванні ексенатиду, але ця невелика зміна не призвела пояснюють істотне поліпшення метаболічних та судинних результатів.

Агоністи GLP-1R можуть зменшити всмоктування кишкових поживних речовин, уповільнюючи спорожнення шлунка (12,36–38). Таким чином, було можливим, що просто затримуючи всмоктування поживних речовин, ексенатид може зменшити постпрандіальне підвищення рівня ліпідів у плазмі крові та концентрації глюкози та відкласти їх пік до наступних прийомів їжі. Тому ми оцінили спорожнення шлунка, вимірюючи поглинений ацетамінофен та d-ксилозу відповідно до їжі на сніданок та обід. Відповідно до попередніх досліджень, що показували повільніше спорожнення шлунку за допомогою агоністів GLP-1R (37,39), після ін’єкції ексенатиду концентрації ацетамінофену після сніданку знижувались. Однак це скорочення було помірним і спостерігалось лише у 2-годинний момент часу. Відповідна рання затримка піку глюкози після їжі узгоджується із участю спорожнення шлунка у знижуючих глюкозу ефектах ексенатиду (37,39). На противагу цьому, невідповідні підвищення показників після їжі між плазмою апоВ48 або тригліцеридів та ацетамінофеном або d-ксилозою вказують на додаткові механізми зниження тригліцеридів ексенатидом, такі як пригнічення вироблення ліпопротеїнів у кишечнику та вивільнення тригліцеридів, як показано раніше (40).

У нашому попередньому дослідженні ЕФ було випробувано лише у осіб з ІГТ або цукровим діабетом дуже короткої тривалості (2) та/або вищих системних рівнів ексенатиду в результаті більш хронічної терапії (11 днів проти разової дози) у поточному дослідженні.

Більше третини впливу ексенатиду на ЕФ у нашому попередньому дослідженні залишалося незрозумілим завдяки змінам поживних речовин у плазмі (14). Незважаючи на те, що незрозуміла частина просто відображала неточне узгодження часових точок вимірювання ЕФ та відбору крові для концентрації глюкози та ліпідів у плазмі крові, ми підозрювали, що ексенатид може мати прямий вплив на ЕФ. Навіть із тимчасово зв’язаними показниками ЕФ та плазми крові у поточному дослідженні, поліпшення ЕФ після ексенатиду лише частково пов’язано зі змінами тригліцеридів у плазмі та концентрації глюкози, що свідчить про додаткову судинну дію ексенатиду. Щоб перевірити цей момент, ексенатид вводили в умовах голодування в дослідженні 2 зі швидкістю, яка, як відомо, досягала концентрацій ексенатиду, порівнянних із концентраціями, отриманими при стандартному дозуванні підшкірної ін’єкції ексенатиду (30). ЕФ посилювався майже на 20% під час інфузії ексенатиду порівняно з плацебо. Це узгоджується з попереднім звітом, що свідчить про покращення ЕФ після підшкірної ін’єкції ексенатиду (24) та попередніми дослідженнями, що демонструють підвищення ЕФ після внутрішньовенної інфузії GLP-1 (17,18).

Ми також припустили, що агоністи GLP-1R покращують EF безпосередньо через ендотеліальні GLP-1R (19). Попередні дослідження in vitro показали, що інгібітор GLP-1R exendin-9 антагонізував активовану eNOS активовану ексенатидом eNOS у культивованих ендотеліальних клітинах (26). Відповідно до цього, екзендін-9 притупив активовану ексенатидом активацію eNOS та вироблення NO в HAEC. Більше того, екзендін-9 повністю скасував ефект інфузії ексенатиду на ЕФ, надаючи важливі докази in vivo щодо участі GLP-1R у вазодилатаційному ефекті агоністів GLP-1R.

Раніше було показано, що агоністи GLP-1R покращують реакції вазодилатації судин гризунів ex vivo (15,16,22). У нашому дослідженні людські артеріоли розширювались залежно від концентрації із збільшенням доз ексенатиду або GLP-1. Важливо, що ексенатид вже був ефективним у концентраціях, подібних до концентрацій, досягнутих при терапевтичному дозуванні (42). Розширення судин інгібував інгібітор eNOS l -NAME, вказуючи на NO-залежний механізм дії ексенатиду. Екзенатид також відновлює опосередковану ендотелієм вазодилатацію, яка послаблюється продуктами ліполізу з високим вмістом глюкози або ЛПНЩ. Захист ексенатиду від погіршення ЕФ, спричиненого високим вмістом глюкози, збігається з раніше повідомленим ефектом GLP-1 під час гіперглікемії in vivo (21). Зараз ми продемонструємо новий висновок, що ексенатид безпосередньо запобігає індукованій ліпідами дисфункцію ендотелію.

З декількох шляхів кінази GLP-1R нижче за течією, які раніше постулювали як відповідні для активації eNOS (25–27), лише AMPK активувався ексенатидом у HAEC. Активація AMPK, як видається, передувала фосфорилюванню eNOS, згідно з повідомленнями про цю послідовність шляхів (43,44). Підтримуючи ключову роль AMPK в ендотеліальній вазодилатації агоністами GLP-1R, AICAR відтворив ефект, а CC інгібував індуковану ексенатидом та GLP-1 вазодилатацію в артеріолах людини. Більше того, CC був майже таким же ефективним, як l -NAME, у блокуванні вазодилатації ексенатиду, а також скасував захист ексенатиду від індукованого ендотелієм опосередкованого ендотелієм вазодилатації ex vivo. У HAECs CC також блокував активовану ексенатидом активацію eNOS та вироблення NO. Щоб виключити можливість того, що CC міг модулювати дію ексенатиду шляхом інгібування інших кіназних шляхів (45), ми збили транскрипцію AMPKα в HUVEC і виявили зменшення продукованої екзенатидом продукції NO в клітинах без AMPKα.

Існує кілька потенційних обмежень дослідження. Більшість учасників були чоловіками, і ми не можемо впевнено розширити свої результати in vivo серед жінок. Хоча попередні докази (46) свідчать, що малоймовірно, що екзендін-9 має судинні наслідки, окрім його втручання в дію ексенатиду, це не можна повністю виключити. PAT було обрано для цього дослідження через його чудову відтворюваність під час повторних вимірювань, хорошу кореляцію із встановленими золотими стандартними методами (дилатація, що опосередковується плечовим потоком, пряме вимірювання ЕФ коронарних артерій та плетизмографія передпліччя) та доведена зв'язок із серцево-судинним ризиком у великих груп населення. (47–49).

На закінчення наші дослідження in vivo та ex vivo показали, що 1) екзенатид агоніста GLP-1R покращував EF протягом двох послідовних прийомів їжі у осіб із діабетом 2 типу короткої та середньої тривалості; 2) ексенатид покращував EF через прямий судинний GLP-1R –Опосередкований механізм, 3) ексенатид за допомогою прямої судинної дії покращує як дисфункцію ендотелію, спричинену високим вмістом глюкози, так і ліпіди, та 4) активність ендетеліального шляху AMPK, що стимулює ексенатид, що призводить до більшої активації eNOS та вироблення NO. Оскільки ендотеліальна дисфункція пов’язана з прогресуванням атеросклерозу (50) і передбачає клінічні серцево-судинні події (1–3), наші результати надають подальшу концептуальну та механістичну підтримку потенційного використання агоністів GLP-1R у серцево-судинному захисті при діабеті 2 типу.

Інформація про статтю

Подяка. Автори визнають чудову допомогу в проектах, яку надали Лінда Макдональд Р.Н., Ірина Мороз, Кіт Расмуссен, Ешлі Хейл та Дьюейн К.Термонд (усі в системі охорони здоров’я Фенікс В.А.).

Фінансування. Цю роботу частково підтримали Американська діабетична асоціація (1-10-CT-31 до JK), Фонд амілоїдозу (до RQM), Національний інститут охорони здоров'я (R21-HL-092344-01 до RQM), VA Merit (BLRD I01BX007080 до RQM) та Управління з досліджень та розробок, Департамент у справах ветеранів (1I01CX000598 до PDR). Амілін Ліллі безкоштовно надавала навчальні препарати.

Зміст цієї статті не відповідає думкам Департаменту у справах ветеранів або уряду США.

Подвійність інтересів. П.Д.Р. отримав гранти на дослідження від Bristol-Myers Squibb. Про інші потенційні конфлікти інтересів, що стосуються цієї статті, не повідомлялося.

Внески автора. J.K. розробив дослідження, отримав фінансування, згенерував дані досліджень та підготував рукопис. РС. та C.B. досліджували дані, переглядали та редагували рукопис. К.М.Д. розробляв експерименти, генерував дані досліджень та редагував рукопис. К.Р. збирав дані та редагував рукопис. Дж. Л. генерував дані досліджень та редагував рукопис. С.Т. та D.A.F. розробляв експерименти та редагував рукопис. E.A.S. допомагав розробляти експерименти, збирав дані та редагував рукопис. D.C.S. допоміг розробити дослідження та відредагував рукопис. Д.Д. проконсультувались щодо проекту дослідження та переглянули рукопис. R.Q.M. допомагав розробляти експерименти, отримував фінансування, переглядав та редагував рукопис. П.Д.Р. допомагав розробляти дослідження та експерименти, отримував фінансування, переглядав та редагував рукопис. J.K. є гарантом цієї роботи і, як такий, мав повний доступ до всіх даних дослідження та несе відповідальність за цілісність даних та точність аналізу даних.

Попередня презентація. Частини цього дослідження були представлені на 73-й науковій сесії Американської діабетичної асоціації, Чикаго, Іллінойс, 21-25 червня 2013 р., І на 74-й науковій сесії Американської діабетичної асоціації, Сан-Франциско, Каліфорнія, 13-17 червня 2014 р.