DSCAM-AS1 сприяє зростанню пухлини раку молочної залози за рахунок зменшення miR-204-5p та регуляції RRM2

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Запис ORCID для Na Li
Для листування: [email protected]

Анотація

Короткий виклад Для визначення експресії DSCAM-AS1 та miR-204-5p при БК використовували аналіз мікрочипів та qRT-PCR. DSCAM-AS1 сприяв проліферації та порушенню апоптозу клітин ВС шляхом зменшення miR-204-5p та посилення експресії RRM2.

Вступ

Рак молочної залози (РМЗ) є поширеною злоякісною пухлиною у всьому світі, і щорічно понад 370 000 жінок помирають через БЦ в усьому світі щорічно (Wang et al., 2017). Основною причиною захворюваності та смертності від BC є невиліковна метастатична хвороба, яка має високу стійкість до традиційної терапії (Xu et al., 2017). Незважаючи на досягнення в діагностиці та терапії, такі як хірургічне втручання, хіміотерапія та опромінення, серед пацієнтів з БК є високі показники рецидивів та метастазування (Wang et al., 2015). Крім того, безперервне лікування променевою та хіміотерапією призводить до менш ефективного знищення ракових клітин через набуту резистентність (Vimalraj et al., 2013). Тому молекулярні механізми, що лежать в основі пухлинного генезу БЦ, потребують подальшого дослідження.

Довгі некодуючі РНК (lncRNAs) визначаються як транскрипти, що мають понад 200 нуклеотидів і не мають здатності кодувати білок (Xu et al., 2017). Повідомляється, що LncRNA беруть участь у прогресуванні пухлини та метастазуванні шляхом регулювання біологічних процесів різних рівнів, таких як альтернативне сплайсинг мРНК, білкова активність, зміни локалізації білка тощо (Huarte, 2015; Xu et al., 2017). Зростаюча кількість літератур повідомляє, що lncRNAs тісно пов'язані з раком людини і беруть участь у контролі доступності для конкретних miRNAs (Bartonicek et al., 2016). У БК повідомлялося про ряд диференційовано експресованих lncRNA та їх кореляцію з пухлинними функціями (Xi et al., 2017; Yan et al., 2017; Zhou et al., 2017). Наприклад, lncFOXO1 помітно регулювався в BC і пригнічував ріст BC завдяки збільшенню транскрипції FOXO1 (Xi et al., 2017). У той час як Linc-ITGB1 сильно регулювався в БК, що сприяло метастазуванню клітин (Yan et al., 2017).

Антисмислова lncRNA DSCAM (молекула клітинної адгезії синдрому Дауна) (DSCAM-AS1), розташована на 21q22.2, транскрибується з антисмислової ланцюга DSCAM, що належить до сімейства імуноглобулінів клітинних молекул адгезії (Zhao et al., 2014). Кілька літератур повідомляють, що DSCAM-AS1 асоціюється з прогресуванням ракових клітин (Miano et al., 2016; Niknafs et al., 2016; Zhao et al., 2014). Чжао та ін. встановили, що DSCAM-AS1 надмірно експресується в аденокарциномі легенів і може взаємодіяти з їх генами-господарями для виконання функції різних підтипів раку легенів (Zhao et al., 2014). Міано та ін. виявили, що надмірна експресія DSCAM-AS1 сприяла зростанню просвітньої клітинної лінії раку молочної залози (Miano et al., 2016). Варто зазначити, Яшар С та співавт. показали, що DSCAM-AS1 може взаємодіяти з hnRNPL для опосередкування прогресування пухлини (Niknafs et al., 2016). Однак вся історія про те, як DSCAM-AS1 опосередкований ріст і прогресування раку молочної залози в основному залишається незвіданим. Тому необхідне подальше розуміння цілей та мереж, регульованих DSCAM-AS1.

Рибонуклеотидредуктаза М2 (RRM2) є каталітичною субодиницею рибонуклеотидредуктази, яка є важливим ферментом, що бере участь у синтезі ДНК, і може регулювати його ферментативну активність (Iwamoto et al., 2015). У кількох публікаціях повідомляється, що RRM2 був надмірно експресованим у різних ракових клітинах (Zhong et al., 2016). Порушення регуляції RRM2 у БК раніше досліджувалося в деяких літературах. Наприклад, RRM2 регулювався в клітинах BC і міг виступати критичним маркером для агресивного BC (Lu et al., 2012). Шах та ін. встановили, що інгібування RRM2 пригнічує ріст пухлини in vivo та зменшує міграцію та інвазивність клітин при БК (Putluri et al., 2014). Кілька досліджень вказували на роль RRM2 як мішені miRNA при раку людини. Результати наших експериментів пояснили механізм регулювання між RRM2 та miR-204-5p.

У поточному дослідженні ми вимірювали рівень експресії DSCAM-AS1 та miR-204-5p у клітинах BC. Згодом ми застосували репортерну систему з подвійною люциферазою, щоб перевірити кореляцію DSCAM-AS1 та miR-204-5p. Потім ефекти DSCAM-AS1 на проліферацію ВЦ, метастази росту та апоптоз вимірювали за допомогою серії експериментів in vitro, включаючи аналіз апоптозу клітин, аналіз CCK-8 та аналіз трансульверу та експерименти in vivo. Крім того, ми також дослідили вплив RRM2 на активність клітин ВС та ріст пухлини. Ці результати підкреслили, що DSCAM-AS1 може бути перспективною терапевтичною стратегією для лікування БК людини.

Матеріали і методи

Зразки тканин

Тканини BC та прилеглі тканини були зібрані у період з січня 2014 р. По серпень 2015 р. У 40 пацієнтів лікарні Приєднаного центру медичного університету Сіньсян. Усі зразки були зібрані у жінок у віці 44-71 років (середній вік: 62,3). До операції пацієнти не отримували жодної хіміотерапії та променевої терапії. Всі зразки тканин були незалежно перевірені трьома патологоанатомами або лікарями перед консервуванням у рідкому азоті при -80 ° C або перенесенням у мікроцентрифужні пробірки, що містять реагент TRIzol, для вилучення РНК. Відповідні характеристики цих 40 пацієнтів описані в таблиці 1. Усі експерименти проводились за інформованою згодою пацієнтів та за погодженням з лікарнею приєднаного центру медичного університету Сіньсян.

Клініко-патологічна характеристика досліджуваних

Культура клітин

Клітинна лінія раку молочної залози людини HCC1937 та лінія клітин ембріональної нирки людини HEK293 були придбані у банку клітин Академії наук Китаю (Шанхай, Китай). Клітини HCC1937 культивували в середовищі RPMI-1640 (GIBCO, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) плюс 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS), 1,5 г/л NaHCO3, 2,5 г/л глюкози, 0,11 г/Л пірувату натрію та 1% (об./Об.) Пеніцилін-стрептоміцину. Клітини HEK293 підтримували в середовищі DMEM з додаванням 10% (об/об) FBS І 1% (об/об) пеніциліну-стрептоміцину.

Аналіз мікрочипів

Дані про тканини пухлини молочної залози були зібрані з бази даних TCGA. R-пакет 'DESeq2' був використаний для нормалізації, ідентифікації та візуалізації диференційовано експресованих міРНК та lncRNA (log2 | Fold Change |> 1 та метод P.adjust - ΔΔCt був використаний для кількісної оцінки відносних значень експресії мРНК. в таблиці 2.

Послідовності праймерів для qRT-PCR

Вестерн-блот

Зразки білка лізували в буфері RIPA (Beyotime, Шанхай, Китай) з коктейлем інгібітора протеази (Roche, Базель, Швейцарія). Після центрифугування концентрацію супернатанту білка вимірювали за допомогою реагенту Бредфорда (Bio-Rad, Каліфорнія, США). Після елюювання SDS-завантажувальним буфером білки електрофорезували в 10% гелі електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), переносили в нітроцелюлозні мембрани (Millipore, США) і блокували. Додавали первинні антитіла (анти-RRM2, ab172476, 1: 2000; анти-GAPDH, ab181603, 1: 10000, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Після екстенсивного промивання TBST додавали вторинне антитіло (Goat anti-Rabbit IgG H&L (HRP), ab6721, 1: 2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) протягом 1,5 год. Виявлення сигналу проводили шляхом імуноблотингу за допомогою системи ECL (Life Technology, США). Для відносної кількісної оцінки ми нормалізували рівень експресії GADPH (як рівень сірого) до 1 і порівняли рівні експресії (рівень сірого) різних експериментальних груп за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

Проточна цитометрія

Апоптоз клітин оцінювали за допомогою набору для виявлення апоптозу Annexin V-PE (Beyotime, Шанхай, Китай) за протоколами виробника. Через 48 годин після трансфекції клітини промивали повторно суспендували в зв'язуючому буфері, що містить йодид пропідію (PI) та анексин V-FITC. Забарвлені клітини аналізували за допомогою проточного цитометра BD Accuri C6 (BD, США) за допомогою програмного забезпечення Cell Quest Pro (BD, США).

Аналіз CCK-8

8 × 10 3 клітин HCC1937 на лунку інкубували в 96 лунок, а життєздатність клітин оцінювали за допомогою Клітингового набору для підрахунку клітин-8 (Біотехвелл, Шанхай, Китай) через 0, 24, 48, 72 та 96 год відповідно до інструкцій виробника. Поглинання реєстрували при 450 нм за допомогою багаторежимної платформи виявлення SpectraMax i3x (Molecular Devices, США).

Аналіз Трансвелла

Клітини суспендували в безсироватковому середовищі і поміщали у верхню камеру з покритим матригелем з 24-лункової камери (Sigma-Aldrich, MO, США). Шістсот мікролітрів, що містять 10% FBS, додавали до нижньої камери протягом ночі. Мігровані клітини фіксували 4% параформальдегідом і фарбували кришталево-фіолетовим кольором. Клітини промивали та підраховували із випадкових полів (збільшення 100 ×). Кожен експеримент проводився тричі.

Аналізи репортерів люциферази

За двадцять чотири години до трансфекції клітини HEK293 висівали на 24-лункову платівку (1 × 10 5/лунку), потім клітини ко-трансфікували pCMV-Renilla (Promega, WI, США) та плазміди-репортери люциферази світлячка pGL3 Promega, WI, США), що містить негативний контроль (NC), або 3'UTR miR-204-5p нижче гена люциферази Firefly, разом з pLenti6.1-DSCAM-AS1, pLenti6.1-DSCAM-AS1 mut # 1 (область 406-427 мутована), або pLenti6.1-DSCAM-AS1 mut # 2 (область 685-706 мутована), і pcDNA3.1 (+) - RRM2 або pcDNA3.1 (+) - RRM2 mut # (область 1949 -1956 з мутацією) з використанням ліпофектаміну 3000 (Invitrogen, Каліфорнія, США) відповідно до рекомендацій виробника. Мутанти були генеровані за допомогою ПЛР, а послідовність показана на Фіг.2A-B, що було підтверджено секвенуванням ДНК. Через сорок вісім годин після трансфекції люциферазну діяльність проводили за допомогою набору аналізів з подвійною люциферазою (Promega, WI, США). Потім заходи люциферази світлячка та реніли вимірювали люмінометром Бертольда (Бундора, Вікторія, Австралія).

Експеримент на тваринах

Для випробувань in vivo HEK293T трансдукували у присутності 8 мкг/мл полібрену і вирощували в культуральному середовищі, що містить 2 мкг/мл пуроміцину, з отриманням частинок лентивируса pLenti6.1-DSCAM-AS1 та pLenti6.1-shDSCAM-AS1. Клітини HCC1937 трансдурувались цими лентивирусними частинками. Потім клітини культивували в середовищі з 3 мкг/мл бластицидину для стабільного виділення клітинної лінії перед підшкірним введенням у правий фланг самок оголених мишей (віком 6-8 тижнів). Розміри пухлини вимірювали кожні 5 днів за допомогою штангенциркуля. Обсяг пухлини оцінювали за допомогою фомули V = (π/6) (W 2 * L), де W = ширина і L = довжина пухлини. Через 30 днів після ін’єкції мишей забивали, а розмір пухлини використовували як кінцеву точку зчитування. Усі дослідження на тваринах були схвалені лікарнею приєднаного центру медичного університету Сіньсян та відповідно до норм лікарні приєднаного центру медичного університету Сіньсян. Дані представлені у вигляді середнього об'єму X ± S.E.

Статистичний аналіз

(A) QRT-PCR показала, що експресія DSCAM-AS1 клітин HCC1937, трансфікованих DSCAM-AS1, була значно вищою, ніж клітини, трансфікованих sh-DSCAM-AS1. (B) Об'єм пухлини групи DSCAM-AS1 був більшим, ніж групи NC із збільшенням часу. (C) Вага пухлини була набагато більшою у групі DSCAM-AS1 порівняно з групою NC на 30 день. (D) Діаграма пухлини на день 30. (E) QRT-PCR показала, що експресія miR-204-5p у групі DSCAM-AS1 була суттєво нижче, ніж у групі NC. (F) QRT-PCR показала, що експресія RRM2 була значно вищою у групі DSCAM-AS1 порівняно з групою NC. (G) Вестерн-блот виявив, що експресія білка RRM2 у групі DSCAM-AS1 була значно вищою, ніж у групі NC.

Обговорення

Ряд публікацій підтверджують, що lncRNAs асоційовані з туморогенезом при БК (Cui et al., 2017). У цьому дослідженні досліджували вплив lncRNA DSCAM-AS1 на БЦ. По-перше, ми виявили, що DSCAM-AS1 суттєво регулюється вгору, тоді як miR-204-5p регулюється в клітинах BC завдяки аналізу мікрочипів та qRT-PCR. По-друге, ми виявили, що DSCAM-AS1 безпосередньо націлений на miR-204-5p за допомогою системи репортерів з подвійною люциферазою. Тим часом результати аналізів CCK-8, трансульверу та проточної цитометрії показали, що DSCAM-AS1 сприяє проліферації та метастазуванню клітин ВС і порушує апоптоз клітин, погіршуючи експресію miR-204-5p. Крім того, ми вивчили взаємозв'язок між miR-204-5p та RRM2 і виявили, що miR-204-5p інгібує експресію RRM2. Більше того, серія експериментів продемонструвала, що RRM2 сприяв сприянню проліферації та метастазуванню клітин ВС, а також придушенню апоптозу клітин. Крім того, експерименти in vivo показали, що збиття DSCAM-AS1 може придушити ріст пухлини.

Раніше повідомлялося, що DSCAM-AS1 як онкогенна lncRNA асоціюється з кількома видами раку людини (Niknafs et al., 2016). DSCAM-AS1 розглядається як основний дискримінант у різних лініях клітин раку та пухлинах (Miano et al., 2016). Наші експерименти показали, що DSCAM-AS1 регулювався в до н.е. Крім того, надмірна експресія DSCAM-AS1 сприяла розмноженню клітин та метастазуванню, а також гальмувала апоптоз клітин у БК. Про низку подібних результатів повідомлялося в попередніх публікаціях. Наприклад, Niknafs et al. встановлено, що DSCAM-AS1 експресується на дуже високому рівні в тканинах BC і сприяє росту та інвазії клітин T47D in vivo (Niknafs et al., 2016). Міано та ін. продемонстрували, що у зразках БК спостерігалася відхилена регуляція DSCAM-AS1 у порівнянні із сусідніми тканинами, а DSCAM-AS1 був пов'язаний з рухливістю, адгезією та інвазією ракових клітин (Miano et al., 2016). Сю та ін. виявило, що нокдаун DSCAM-AS1 пригнічує проліферацію клітин BC і прогресування циклу, а також посилює апоптоз клітин in vitro (Xu et al., 2017).

MiR-204-5p передбачали як антионкогенну молекулу при багатьох видах раку (Luo et al., 2017). У кількох публікаціях повідомляється, що експресія miR-204-5p була знижена в різних пухлинах і діяла як потужний супресор пухлини, що інгібує проліферацію та метастазування пухлини, включаючи гепатоцелюлярну карциному, орально-плоскоклітинний рак та BC (Jiang et al., 2016; Wang et al., 2016; Zeng et al., 2016). У е. До н. Е. Li et al. показали, що експресія miR-204 значно знижується порівняно з сусідніми нормальними тканинами ВС, і втрата miR-204 може сприяти проліферації та інвазії клітин ВС (Luo et al., 2017). Крім того, miR-204-5p може взаємодіяти з lncRNA для здійснення додаткової регуляції росту пухлини. Ван та співавт. виявили, що знижена регуляція MALAT1 підвищує експресію miR-204 у клітинах BC і інгібує клітинну інвазію шляхом зворотного епітеліально-мезенхімального переходу (Wang et al., 2017). На підставі попередніх досліджень ми далі досліджували взаємозв'язок miR-204-5p та DSCAM-AS1 з патологією БЦ. Результати показали, що miR-204-5p пригнічує розмноження клітин ВС та посилює апоптоз клітин, експресія яких гальмується DSCAM-AS1.

RRM2, як ключовий ген у метаболізмі піримідину, корелював з різними пухлинами людини (Putluri et al., 2014). Попередні літератури повідомляли, що RRM2 мав високу експресію при раку і брав участь у агресивності пухлини, поганому прогнозі та хіміорезистентності (Shah et al., 2015) Наприклад, Sturtz et al. продемонстрували, що RRM2 експресується на більш високих рівнях в пухлинних тканинах, що пов'язано з регуляцією клітинного поширення та інвазивністю (Sturtz et al., 2014). Шах та ін. виявило, що RRM2 був надмірно експресованим у стійких до тамоксифену клітинах ВЦ, і посилив проліферацію та метастазування клітин MCF-7 до нашої ери (Shah et al., 2015). Послідовно ми виявили, що RRM2 регулювався в до н.е. Тим часом серія експериментальних результатів показала, що вплив RRM2 на активність клітин ВС був зворотно змінений за допомогою miR-204-5p. Ми чітко дослідили молекулярний механізм, що лежить в основі DSCAM-AS1, miR-204-5p та RRM2, і вперше виявили їх взаємозв'язок у БК.

Однак деякі недоліки нашого дослідження слід враховувати в наступних наших дослідженнях. Наприклад, слід проводити експерименти in vitro DSCAM-AS1 та RRM2, щоб всебічно зрозуміти молекулярну мережу DSCAM-AS1, miR-204-5p та RRM2 у БК.

Висновок

На закінчення ми підтвердили, що DSCAM-AS1 був підвищений у клітинах BC, DSCAM-AS1 сприяв проліферації та метастазуванню клітин BC і пригнічував апоптоз клітин шляхом інгібування miR-204-5p та збільшення експресії RRM2. Отже, це дослідження припускає, що інгібування DSCAM-AS1 може бути перспективною терапевтичною стратегією для лікування БК.

Розкриття інформації

Конкуруючі інтереси

Автори заявляють, що з рукописом немає жодних суперечливих інтересів.

Схвалення етики та згода на участь

Усі процедури, проведені в дослідженнях із участю людей та тварин, відповідали етичним стандартам лікарні Приєднаного центру медичного університету Сіньсян. Письмові інформовані згоди були отримані від усіх окремих учасників, включених у дослідження.

Згода на публікацію

Автори дають згоду на публікацію.

Наявність даних та матеріалів

Набори даних, використані та проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за обґрунтованим запитом.

Внески авторів

Суттєвий внесок у задум і дизайн твору: Вень-Хуей Лян і На Лі; Аналіз та інтерпретація даних: Чжи-Цін Юань, Чжи-Хуей Ван та Сінь-Лай Цянь; Складання рукопису: Вень-Хуей Лян і На Лі; Критичний перегляд твору щодо важливого інтелектуального змісту: Na Li; Збір грантів: Na Li; Остаточне схвалення роботи: Усі автори.

Фінансування

Це дослідження було частково підтримано грантами Фонду природничих наук провінції Хенань, Китай (№ 162300410220), Комісії з питань освіти провінції Хенань, Китай (№ 16A310002, № 18A310004), Фонду науки і техніки провінції Хенань, Китай (№ 201403133).