Дієтичне ожиріння сприяє розвитку пухлини товстої кишки у мишей, які отримували азоксиметан

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

ожиріння

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Поточна адреса: Ferring Pharmaceuticals Inc., Парсіппані, Нью-Джерсі, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ захворювань органів травлення, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

  • Ійна Туомінен,
  • Лейна Аль-Рабаді,
  • Димитріс Ставракіс,
  • Йорданіс Карагіанідес,
  • Харалабос Потулакіс,
  • Джеймс М. Бугні

Цифри

Анотація

Цитування: Tuominen I, Al-Rabadi L, Stavrakis D, Karagiannides I, Pothoulakis C, Bugni JM (2013) Дієтичне ожиріння сприяє розвитку пухлини товстої кишки у мишей, оброблених азоксиметаном. PLoS ONE 8 (4): e60939. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060939

Редактор: Джун Сан, Медичний центр університету Раша, Сполучені Штати Америки

Отримано: 21 грудня 2012 р .; Прийнято: 5 березня 2013 р .; Опубліковано: 3 квітня 2013 р

Фінансування: Цю роботу підтримали Національний інститут охорони здоров’я (RO-1 DK60729, CP), CURE (премія нового дослідника: Центр досліджень захворювань органів травлення 41301, JMB), Фонд Мартіна Бліндера для досліджень ВЗК (CP) та Сігрід Юселій Фонд (докторська стипендія, ІТ). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Ожиріння є всесвітньою епідемією і сильно схиляє до різних захворювань, включаючи рак. Ожиріння, як оцінюється за індексом маси тіла (ІМТ), суттєво корелює з підвищеним ризиком множинних видів раку, включаючи стравохід, щитовидку, товсту кишку, нирки, ендометрій та жовчний міхур [1]. Важливо, що ризик раку товстої кишки різко зростає із ІМТ, оскільки кожне поетапне збільшення на 5 кг/м 2 пов’язане із збільшенням ризику раку на 18% [2] та порівнянним збільшенням ризику аденоми [3].

Оскільки ожиріння пов’язане з більшим споживанням жирів та харчових ліпідів, які можуть впливати на розвиток раку товстої кишки незалежно від ожиріння, важко відокремити ці фактори епідеміологічно та емпірично. Компоненти HFD та тип споживаних жирних кислот мають сильний вплив на пухлину товстої кишки, що свідчить про те, що вони можуть безпосередньо впливати на ризик розвитку раку [12]. Механізми, за допомогою яких різні харчові жири збільшують канцерогенез товстої кишки, незалежно від ожиріння, до кінця не вивчені, але можуть включати вплив на експресію онкогену в слизовій оболонці товстої кишки [12], [13], секрецію жовчних кислот [14] або окислювальний стрес з-за гіпероксидизується тригліцериди [15].

Дослідження хімічного канцерогенезу на мишачих моделях, як правило, показують посилення ефекту від пухлини, що підсилює пухлину, та пов'язане з цим ожиріння [14], [16]. Дієта західного типу з високим вмістом жиру та низьким вмістом кількох основних поживних речовин може посилити утворення пухлин навіть без лікування канцерогеном [17]. Більше того, генетичні моделі мишей припускають, що ожиріння, що розвивається без годування HFD, призводить до розвитку пухлини. Наприклад, миші з дефіцитом лептину (ob/ob) та дефіцитом рецепторів лептину (db/db) демонструють підвищену чутливість до розвитку пухлини товстої кишки [7], [18]. Ці тварини страждають на імунні та гормональні порушення, які можуть змішувати вплив надлишку жирової тканини на канцерогенез. Моделі DIO ідеально відображають ожиріння людини та метаболічний синдром. Однак вони, як правило, мають той самий незрозумілий елемент, що і дослідження на людях - можливий незалежний вплив харчового жиру на епітеліальні клітини товстої кишки та метаболічні функції.

Ми застосували новий підхід для визначення наслідків ожиріння без постійного ВЧС на розвиток пухлини товстої кишки. Після індукування ожиріння HFD мишам вводили звичайну дієту перед лікуванням азоксиметаном (AOM) для індукування пухлин товстої кишки. Отже, протягом усього канцерогенного періоду ці миші сиділи на тій самій дієті, що і контрольні миші, і тим не менш частота і множинність аденоми товстої кишки значно зростали. Це перше дослідження, яке показало, що ожиріння саме по собі сприяє розвитку пухлини товстої кишки, не викликаючи незрозумілих наслідків триваючої СНЧ або генетичних порушень.

Методи

Годування та лікування азоксиметаном (AOM)

Заява про етику

Протокол дослідження був затверджений Комітетом з досліджень тварин канцлера при Університеті Каліфорнії, Лос-Анджелес (ARC № 08–127). Дослідження проводилось відповідно до рекомендацій Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту охорони здоров’я. Тварин гуманно евтаназували за допомогою інгаляції СО2 з подальшим вивихом шийки матки.

Вміст жиру в організмі

До евтаназії вимірювали жир і худою масу тіла за допомогою аналізатора складу всього тіла EchoMRI.

Кількісна ПЛР

Товсті кишки мишей, принесених в жертву через один день після остаточної дози AOM, були розсічені, а шматочки із середньої кишки заморожені в рідкому азоті. РНК готували двоступеневим методом із використанням тризолу (Invitrogen, Carlsbad, CA) та міні-колонок RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). КДНК першої ланцюга була синтезована за допомогою набору SuperScript III First-Strand Synthesis, грунтованого випадковими гексамерами, і експресія генів оцінювалась за допомогою хімії TaqMan, Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR і наступних праймерів: TNF-α (Mm00443260_g1), IFN -γ (Mm01168134_m1), IL-6 (Mm00446190_m1) та IL-1β (Mm00434228_m1) (AB, Фостер-Сіті, Каліфорнія).

Імуногістохімія та оцінка апоптозу

Товста кишка мишей, принесених в жертву через день після остаточної дози AOM, фіксували у формаліні на 16 годин і вкладали у парафін. Поперечні зрізи принаймні 3 різних частин, що утворюють серединну товсту кишку, були пофарбовані H&E. Апоптоз оцінювали в нижній половині крипти за морфологічними особливостями ядерної конденсації, ядерної фрагментації та цитоплазматичного мікстування. Проліферацію оцінювали за допомогою фарбування Ki67 з використанням набору Vectastain ABC та реагенту Vector DAB згідно з інструкціями виробників (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Довжини Ki67-позитивних проліферативних зон вимірювали за допомогою програмного забезпечення Zeiss AxioVision. Як для апоптозу, так і для довжини проліферативної зони, було оцінено щонайменше 100 крипт із трьох розділів.

Статистичний аналіз

Порівняння парності множинності пухлини, довжини проліферативної зони та апоптозу статистично порівнювали за допомогою непараметричного тесту Манна-Уітні та парне порівняння захворюваності на пухлини за допомогою точного тесту Фішера. ПЛР-аналіз у реальному часі експресії генів тестували за допомогою двостороннього ANOVA. Всі аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (Сан-Дієго, Каліфорнія).

Результати

Дієтичне збільшення маси тіла та вмісту жиру в організмі сприяє розвитку пухлини

Щоб визначити вплив ожиріння, без незрозумілого ефекту триваючого ВЧС, на розвиток пухлини товстої кишки, ми розробили чотири експериментальні групи годування/лікування канцерогеном (рис. 1А). Протягом усього канцерогенного періоду (лікування АОМ та після) миші групи HR та R перебували на одній і тій же звичайній дієті, а миші групи H та RH - на HFD. Після 8 тижнів, які застосовувались або з HFD, або з регулярною дієтою, миші в групі HR мали ваги, порівнянні з вагами в групі H (рис. 1B). Подібним чином, миші в RH мали вагу, порівнянну з вагою у групі R. Миші в групі HR втратили найбільшу вагу (25%) під час лікування AOM і досягли тієї ж ваги, що і миші групи R, через 9 тижнів після зміни дієти. Миші в групі RH набирали вагу під час та після лікування AOM, але важили менше, ніж у групі H протягом усього дослідження (рис. 1B). Хоча миші в групі HR мали лише трохи більшу вагу, ніж миші групи R через один день після лікування AOM, їх вміст жиру в організмі був у 1,38 рази вище (рис. 1C), як визначено за допомогою Ехо МРТ. Миші групи RH та H мали 1,81-кратний та 2,89-кратний вищий відсоток жиру в організмі відповідно, ніж миші групи R після лікування AOM (рис. 1C), а в кінці дослідження вони мали 2,23-кратного та 3,05-кратного більший вміст жиру в організмі, відповідно, ніж у мишей R (рис. 1D).

Схематичне зображення ожиріння, спричиненого дієтою (DIO), та індукції пухлини з віком тварини (A). Середня маса тіла показана для всіх груп мишей з часом 0, що відображає час, коли дієти змінювались у групах RH та HR, як описано в методах. Період 5 тижневих процедур АОМ показаний на осі х (В). Відсоток маси тіла, що складається з жиру, вимірювали за допомогою Ехо-МРТ для тварин, евтаназованих через 1 день після останньої обробки АОМ (5 тварин на групу), та нелікованих тварин, які отримували однаковий дієтичний режим (2 або 3 тварини на групу) (C) . Такі самі вимірювання проводились для тварин, оброблених АОМ, через 23 тижні після остаточного лікування АОМ (8 тварин на групу) (D).

У переважної більшості мишей, які регулярно харчувались (група R), не було аденоми, лише у 1/15 (0,07) тварини розвинулася одна аденома (рис. 2А), згідно з попередніми дослідженнями, які показали, що штам C57BL6/J є відносно стійкий до індукованого АОМ канцерогенезу [19]. Частота пухлин була збільшена у всіх групах, які отримували СНЧ: 5/15 (0,33) у H, 5/14 (0,36) у RH та 6/13 (0,46) у HR; зі значним збільшенням ЧСС проти Р (Рисунок 2. Ожиріння та ВЧС посилюють розвиток пухлини товстої кишки.

Пухлини товстої кишки були оцінені через 23 тижні після остаточного лікування АОМ та показані цифри, що спостерігаються за допомогою стереомікроскопії (А). Розміри пухлини вимірювали відкаліброваною очною сіткою і показані групою в (B). ACF на тварину наведено в (C).

Індукований AOM апоптоз та проліферація крипт збільшуються у мишей, які перейшли з високої жирності на звичайну дієту

Тварин приносили в жертву через 24 години після остаточної обробки АОМ і оцінювали апоптоз у зрізах, пофарбованих H&E, за такими гістологічними характеристиками: цитоплазматичне знешкодження, конденсація ядер та фрагментація ядер. Представницьке апоптотичне тіло позначено білою стрілкою в (А). Кількість і стандартне відхилення апоптозів на крипту показано для кожної тварини (В). Довжину зони проліферації визначали фарбуванням Ki67. Типовий склеп із мірною стрічкою від програмного забезпечення AxioPhot показаний у (С). Середня довжина зони проліферації на одну тварину показана в (D).

Лікування AOM індукує експресію IFN-γ в товстій кишці незалежно від дієти

Експресію генів 4 цитокінів, TNF-α, IL-6, IFN-γ та IL-1β вимірювали в РНК, виділеній із загальної товстої кишки, через 24 години після остаточної обробки АОМ (5 тварин на групу) та за віком відповідали необробленим тваринам, отримували однаковий дієтичний режим (2 або 3 тварини на групу). Показані відносні значення виразу (середнє значення +/− st. Dev).

Обговорення

Хоча ми не спостерігали різниці експресії товстої кишки у запальних цитокінах на рівні мРНК, можливо, різні адипокіни, гормони та прозапальні цитокіни є потенційними посередниками впливу ожиріння на розвиток раку товстої кишки. Дослідження на мишах з використанням DIO показали підвищену експресію TNF-α в товстій кишці у тварин, що харчуються HFD [22], [35]. Лю та співавт. повідомили, що HFD протягом 12 тижнів, без лікування канцерогеном, збільшував експресію TNF-α в товстій кишці на 72% [22]. Дінг та ін. повідомлялося про збільшення експресії TNF-α в клубовій, а не в товстій кишці після годування HFD, що передувало гіперінсулінемії та збільшенню ваги [23]. Показано, що IL-6 підвищується в дистальній частині товстої кишки після годування HFD [16]. У дослідженні Mentor-Marcel та співавт. (2009), різні прозапальні цитокіни, включаючи IL-6 та IFN-γ, були збільшені в сироватці крові мишей ob/ob на попередніх злоякісних, але не в запущених стадіях розвитку AOM-індукованої пухлини товстої кишки [24]. Крім того, рівень IL-6 був знижений у цих тварин після дієтичного втручання як у сироватці, так і в слизовій оболонці товстої кишки [24]. На додаток до прозапальних цитокінів, підвищений рівень інсуліну, який може стимулювати прожиття та сигналізацію про зростання в епітеліальних клітинах, є ключовим кандидатом для опосередкування впливу ожиріння на розвиток раку товстої кишки [10].

Підводячи підсумок, усі миші, яких годували HFD, продемонстрували збільшення кількості аденом, зокрема тих, хто перейшов з HFD на звичайну дієту перед впливом канцерогену. Таким чином, це дослідження демонструє, що попереднє ожиріння, спричинене ВЧЧ, навіть без збереженого ВЧС та збільшення ваги, сприяє розвитку пухлини товстої кишки. Потрібні подальші дослідження для визначення відповідної ролі різних адипокінів, гормонів та цитокінів у цьому складному процесі.

Внески автора

Задумав і спроектував експерименти: JMB CP. Виконував експерименти: JMB IT LA DS IK. Проаналізував дані: JMB IT. Написав статтю: JMB IT. Сприяв інтелектуальному змісту та затвердив остаточну версію: IT LA DS IK CP JMB.