Дефект метаболізму сприяє ожирінню у мишей, у яких відсутні рецептори меланокортину-4

Внесені Річардом Д. Пальмітром

Анотація

Нульові миші з рецептором меланокортину-4 (Mc4r) демонструють ожиріння пізнього початку. Щоб визначити, чи аберрантний метаболізм сприяє ожирінню, споживання їжі мишами Mc4r-null обмежувалось (споживанням в парі) споживанням мишами дикого типу (WT). Жінки, що годували парами Mc4r-null, підтримували вагу тіла, проміжну до ваги WT, і самки Mc4r-null, що не годувались парами, тоді як годування парою нормалізувало вагу тіла мишей-самців Mc4r-null. Рівні жирової прокладки та циркулюючого лептину були підвищені як у самців, так і у жінок, які годувались парами мишей Mc4r-null порівняно з мишами WT. Споживання кисню мишами Mc4r-null з такою ж масою тіла, як контролі WT, було зменшено на 20%. Рухова активність молодих небідних самців Mc4r-нуль була значно нижчою, ніж у чоловіків WT; однак пересування молодих небідних самок було нормальним. Температура тіла у основних мишей Mc4r-null була нормальною, і вони нормально реагували на вплив холоду. Молоді нонобезні самки Mc4r-null не змогли індукувати роз’єднання білка 1 (UCP1) у коричневій жировій тканині у відповідь на периферичне введення лептину, тоді як іРНК UCP1 збільшилася на 60% у жінок із ВТ. Ці результати вказують на те, що дефіцит Mc4r підвищує калорійність, подібно до тієї, що спостерігається при синдромі ожиріння Агуті та у нульових мишей з рецептором меланокортину-3.

Аналіз мутацій у локусі агуті (А) разом із фармакологічними дослідженнями, що включають рекомбінантний білок агуті, дали уявлення про контроль пігментації та маси тіла. Пептид агуті, як правило, виробляється і тимчасово виділяється в шкірі, де антагонізує дію гормону, що стимулює α-меланоцити (α-MSH), діючи на рецептор меланокортину-1. Ця взаємодія призводить до осадження смуг жовтого пігменту на чорних волосках, що створює колір шерсті агуті (1, 2). У мишей було виявлено декілька спонтанних хромосомних делецій, які ставлять ген агуті під контроль сусідніх повсюдно експресованих промоторів (3). У гетерозиготних мишей із летальними жовтими (A y) та життєздатними жовтими (A vy) мутаціями спостерігається синдром, відомий як „синдром жовтої миші”, що характеризується ожирінням, що починається з зрілості, посиленим лінійним зростанням, гіперлептінемією, гіперінсулінемією, неінсулінозалежним цукровим діабетом і жовте хутро (4). Гомозиготи цих алелей гинуть внутрішньоутробно через втрату основних генів (5).

Миші з кількома копіями гена агуті, експресовані під контролем специфічного для шкіри промотору, виявляли жовте хутро, але не виявляли фенотипів, пов'язаних з ожирінням, характерних для синдрому жовтої миші (6). Дослідження in vitro показали, що білок агуті також може протидіяти рецептору меланокортину-4 (Mc4r) (7), що виражається переважно в нервовій системі з високим рівнем гіпоталамуса (8, 9). Оскільки гіпоталамус відіграє вирішальну роль у регуляції апетиту та швидкості метаболізму, було висловлено припущення, що антагонізм Mc4r з боку агуті може бути причиною ожиріння мишей A y та A vy. Миші з цілеспрямованим порушенням гена Mc4r (Mc4r-null) відтворювали фенотип ожиріння мишей з синдромом Агуті, підтверджуючи цю гіпотезу (10).

Вважається, що переривання передачі сигналів лептину або α-MSH в гіпоталамусі є основною причиною ожиріння мишей A y (11) та Mc4r-null. Лептин - гормон, що виробляється жировою тканиною, який передає рівень запасів енергії в організмі мозку. Тварини, яким не вистачає функціонального лептину, миші, що страждають ожирінням, мають низький рівень метаболізму. Лептин подає сигнали через проопіомеланокортин (POMC), що містять нейрони в дугоподібному ядрі, а також інші ядра в гіпоталамусі (12). POMC є попередником α-MSH, агоністом Mc4r. Ці нейрони, що експресують POMC, проектуються на бічний гіпоталамус і паравентрикулярне ядро, де знаходиться Mc4r. Встановлено, що активація цього сигнального шляху лептин-меланокортин впливає на споживання їжі та швидкість метаболізму. Дорослі миші A y не реагують на s.c. лептину і вимагають у 100 разів більшої кількості лептину для пригнічення годування (13). Подібним чином, дорослі миші Mc4r-null стійкі до дії лептину (внутрішньовенно або централізовано) щодо прийому їжі (14).

Як миші Mc4r-null (10), так і миші A y (4, 15–17) стають гіперфагічними; проте кілька експериментів свідчать про те, що метаболічний компонент сприяє їх ожирінню. Експерименти на мишах A vy (16) та нульових мишах рецептора меланокортину-3 (18) вказують на те, що ці мутантні штами мишей ефективніше зберігають калорії у вигляді жирової тканини, ніж контролери дикого типу (WT). Вимірювання споживання кисню вказує на те, що миші із ожирінням A y мають нижчий рівень метаболізму у спокої при тестуванні у віці від 2 до 12 місяців (19), але не при тестуванні у віці 6 тижнів. Нарешті, швидкість метаболізму дорослих Mc4r-null, які були значно важчими, ніж контрольні миші, була меншою, ніж товстий контроль або контроль ожиріння, спричинений дієтою, коли нормалізувався до загальної маси тіла (20).

Якщо Mc4r є критичним посередником метаболізму та індукованого дієтою термогенезу, тоді нуклеотидні миші Mc4r повинні бути ефективнішими в метаболічному відношенні, ніж контрольні миші, і повинні набирати більше ваги (як жирова тканина), ніж контрольні миші з однаковим споживанням їжі (тобто демонструють підвищений ефективність подачі). Ми провели довготривалі експерименти з парним вигодовуванням, які показали, що миші Mc4r-null, як миші з синдромом жовтої миші та миші-нульові рецептори меланокортину-3 (18), виявляють схильність до зберігання калорій як жирової тканини. Для подальшої характеристики цього метаболічного дефекту ми протестували споживання кисню, рухову активність, чутливість до холоду та здатність лептину індукувати мРНК UCP1 у мишей Mc4r-null.

Матеріали і методи

Усі процедури на тваринах відповідали настановам Національного інституту охорони здоров’я та були затверджені Комітетом з питань догляду за тваринами університету Вашингтона.

Експерименти з годуванням пар.

Мишей покоління F4 із змішаним гетерозиготним фоном гетерозиготних 129/Sv × C57BL/6J для порушеного алелю Mc4r виводили для отримання мишей Mc4r-нуль та WT безплідних мишей (10). Генотипування проводили, як описано (14). Мишей підтримували на стандартному чау-чау для мишей (стандартна лабораторія для мишей H8604 Харліна Теклада) при температурі 22 ° C протягом 12-годинного циклу світло-темрява. Споживання їжі мишами WT вимірювали щодня, починаючи приблизно з 5 тижнів. Щодня груповим самцям і самкам Mc4r-нульових мишей давали середню кількість їжі, яку споживали їхні односемейні підстилки WT попереднього дня (27). Окремим групам утримуваних у групі самців і самок мишей Mc4r-null був наданий доступ за умови вільного доступу до їжі. Ваги тіла вимірювали щотижня.

Вимірювання жирової прокладки.

WT, миші Mc4r-null та Mc4r-null, що харчуються пари, з вільним доступом до їжі, були вбиті у віці 38–46 тижнів. Пахова, заочеревинна, репродуктивна, лопаткова біла жирова тканина, а також лопаткова коричнева жирова тканина були негайно розсічені та зважені.

Вимірювання сироватки.

Стовбурову кров відбирали у мишей, яких годували ad libitum у спіральних пробірках Microtainer, що містять EDTA (Becton Dickinson), і негайно центрифугували при 2000 об/хв протягом 10 хв при кімнатній температурі. Плазму збирали і заморожували при -60 ° C. Для вимірювання рівня лептину та інсуліну проводили аналізи ІФА (Chrystal Chem, Чикаго). Рівні глюкози визначали за допомогою аналізатора глюкози YSI Select (Yellow Springs Instruments).

Рухома активність.

Амбулаторну активність мишей WT та Mc4r-null, які відповідають віку (віком 4–8 тижнів), вимірювали у прозорих клітках з оргскла (40 × 20 × 20 см), оточених алюмінієвою рамою, оснащеною інфрачервоними променями (San Diego Instruments). Мишей поміщали в клітини протягом дня, а перерви променя вимірювали протягом першої години. Тварини залишалися в клітках протягом ночі з наявністю їжі та води за бажанням, а перерви світлового та темного циклів вимірювали, починаючи з другого дня. Кількість послідовних розривів променя, що відбувались кожну годину протягом 24-годинного періоду, вимірювали та перетворювали в пройдені метри, використовуючи відстань між балками (8,8 см) як коефіцієнт перетворення.

Толерантність до холоду.

Температуру основного тіла мишей вимірювали при кімнатній температурі за допомогою телетермометра (модель 43TA, Yellow Springs Instruments), оснащеного ректальним зондом (модель 402, Yellow Springs Instruments). Зонд був введений на 5 см у товсту кишку. Потім мишей поміщали в кімнату з температурою 4 ° C, і температуру тіла вимірювали аналогічно через 1, 4, 8 і 24 год після холодного впливу.

Вимірювання непрямого споживання O2 (VO2).

Мишам WT та NPF Mc4r-null, віком 7,5–8,5 тижнів, дозволили акліматизуватися до експериментальних умов, помістивши в камеру непрямого калориметра з відкритим контуром (Oxymax; Columbus Instruments) на 3 години в день аналізу. Вимірювання проводили приблизно з 12:00 год. Швидкість потоку свіжого повітря на вході становила 0,5 л/хв, швидкість потоку зразка становила 0,5 л/хв, і камера відбирала проби протягом 60 с з часом переселення 60 с. Повідомлені значення є засобом 60 вимірювань протягом 2-годинного періоду для кожної тварини. Не було значної різниці у споживанні кисню між самками та самцями кожного генотипу; отже, результати для цих двох груп були об'єднані.

Вимірювання мРНК UCP1.

Ін’єкції лептину (рекомбінантна миша; Calbiochem) виконували, як описано (25). Коротко, 5,5-тижневим самкам мишей WT та Mc4r-нуль ін'єктували один раз на день рекомбінантний мишачий лептин 20 мкг/г маси тіла або еквівалентний об'єм носія PBS через 3 год після початку світлового циклу протягом 3 днів у Кімната 22 ° C. Через три години після останньої ін’єкції мишей вбивали, а BAT видаляли. Загальні нуклеїнові кислоти виділяли з НДТ, а відносні рівні мРНК UCP 1 визначали кількісно, як описано (28).

Статистичний аналіз.

Усі значення подаються як середні значення ± SEM. Повторні заходи ANOVA та post hoc тест Тукі були проведені для рис. 1. Тести ANOVA та Tukey post hoc були проведені для таблиці 1 та рис. 2 і 7. Проведено t-тести Стьюдента для рис. 3–6.

Криві зростання. (A) Щотижнева вага тіла 12 Вт, 14 PF Mc4r-нуль та дев'ять жінок NPF Mc4r-null. *, Перший тиждень, коли маса тіла суттєво різнилася у жінок із ВТ та НПФ (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Рівень лептину, інсуліну та глюкози в сироватці крові у WT, PF Mc4R-null та NPF Mc4R-null мишей

Споживання їжі. Споживання їжі вимірювали протягом 5 днів і повідомляли як середньодобове. Вимірювання проводили в першому віці, коли вага тіла значно відрізнялася, і в 14 тижнів. (A) П’ять самок WT та п’ять самок Mc4r NPF. (B) П’ять WT і п’ять NPF Mc4r-нульові самці. *, Значуща відмінність від мишей WT (миші P vy, у яких лише самці були гіперглікемічними (10, 29).

Збільшення маси тіла у жінок NPF Mc4r-null у віці 12 тижнів та у чоловіків NPF Mc4r-null у 10 тижнів відбулося за відсутності будь-якої значної гіперфагії (рис. 3). Ці результати підтверджують роль Mc4r у регуляції метаболізму.

Основна температура тіла та реакція на холод. Температуру тіла в окремо розміщених мишах вимірювали до і через 1, 4, 8 та 24 год після розміщення мишей при 4 ° C. (A) Вісім WT і сім самок мишей Mc4r-нуль. (B) Шість WT та шість нульових самців мишей Mc4r.

Вплив лептину на мРНК UCP1 у БАТ. Самки WT (n = 6) та Mc4r-null (n = 6) мишей утримувались індивідуально протягом 1 тижня перед лікуванням лептином. Мишам вводили щодня 20 мкг/г маси тіла лептину або еквівалентний об'єм носія PBS протягом 3 днів. Гібридизацію розчину застосовували для вимірювання рівнів мРНК UCP1 щодо вмісту загальної нуклеїнової кислоти. *, Значне збільшення відносно транспортного засобу (миші P vy (16) та демонстрація схильності до накопичення калорій як жирової тканини. Frigeri та ін. (16) не спостерігали сексуально-диморфного ефекту у своєму дослідженні щодо ефективності використання їжі при A Vy мишей. Рівень лептину в сироватці крові мишей PF Mc4r-null також відображав їх підвищену ожиріння. Пара, що годує, нормалізувала рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові, підтримуючи зменшення споживання калорій як ефективне лікування цукрового діабету 2 типу.

Найбільш переконливі дані, що свідчать про те, що Mc4r функціонує в регуляції метаболізму, полягає в тому, що збільшена маса тіла самок NP4 Mc4r-null у віці 12 тижнів та чоловіків NPF Mc4r-null у 10 тижнів сталася за відсутності будь-яких значна гіперфагія (рис. 3). Лише у віці 14 тижнів, коли нуклеотидні самочки NPF Mc4r-нуль становили 4,3 ± 1,4 г, а самці були на 10,9 ± 1,8 г важчі, ніж контролі ЗТ, вони стали споживати значно більше їжі. Цей результат свідчить про те, що метаболічний дефіцит є основною причиною того, що тварини Mc4r-null набирають вагу і що гіперфагія виникає вдруге для підтримки тварин, що збільшують масу тіла. Ця гіпотеза надалі підтверджується вимірюванням швидкості метаболізму у молодих тварин із подібною масою тіла. Ми виявили, що нуль-тварини Mc4r споживають на 20% менше кисню, ніж миші WT однакової ваги (рис. 6).

Сигналізація Mc4r може впливати на метаболізм різними способами. Миші Mc4r-null нормально реагували на холодні температури; однак молоді, худорляві самки Mc4r-null не індукували мРНК UCP1 у відповідь на лептин. Наші результати узгоджуються з результатами, про які повідомляють Сатох та ін. (21), який виявив, що індукція UCP1 лептином (що вводиться централізовано) може бути заблокована центральним введенням антагоніста Mc4r, SHU9119. У сукупності ці результати дозволяють припустити, що Mc4r бере участь у опосередкуванні активації лептину SNS та подальшому термогенезі, викликаному дієтою.

Лептин регулює споживання їжі та витрату енергії (31); проте незрозуміло, чи впливає лептин на ці процеси за допомогою окремих або загальних сигнальних шляхів. Раніше ми показали, що щодо споживання їжі ожирілі миші Mc4r-null були стійкі до лептину, тоді як молоді худорляві миші Mc4r-null були частково чутливі до лептину, припускаючи, що стійкість до лептину щодо споживання їжі у мишей Mc4r-null є принаймні частково наслідком ожиріння тварин (14). Тут ми показуємо, що нездатність лептину індукувати мРНК UCP1 у самок Mc4r-null очевидна, коли миші молоді та худі. Таким чином, миші Mc4r-null не чутливі до опосередкованого лептином енерговитрат, перш ніж вони стануть повністю стійкими до спричиненого лептином гальмування споживання їжі. Цей результат підкріплює уявлення про те, що дефектне регулювання витрат енергії мишами Mc4r-null призводить до ожиріння і що компенсаторне підвищення апетиту відбувається після того, як тварини збільшують вагу тіла.

Представлені тут дані вказують на те, що миші Mc4r-null є більш метаболічно ефективними, ніж миші WT. Нещодавно про подібну знахідку повідомляли для нульових мишей меланокортин-3-рецепторів (18). Мутації Mc4r у людей були пов'язані з переважно успадкованою формою ожиріння (32, 33). Багато аспектів регуляції енергетичного гомеостазу та центральної системи меланокортину схожі на мишей та людей (оглянуто в посиланні 34). Однак незрозуміло, чи є люди з мутаціями Mc4r більш метаболічно ефективними. Недавній звіт вказує на те, що кавказці з гетерозиготними мутаціями Mc4r мають нормальну базальну швидкість метаболізму, тоді як індійські/пакистанські суб'єкти з гетерозиготними або гомозиготними мутаціями Mc4r демонструють тенденцію до негативних відхилень в базальній швидкості метаболізму (35).

Виноски

↵ † Поточна адреса: Merck & Co., Box 2000, Rahway, NJ 07065.

↵ § Кому слід адресувати запити на передрук. Електронна пошта: palmiteru.washington.edu .

Стаття опублікована в Інтернеті перед друком: Proc. Natl. Акад. Наук. США, 10.1073/ст. 220409497.