Curdlan запобігає когнітивному дефіциту, викликаному дієтою з високим вмістом жиру у мишей, через вісь кишково-мозку

Сяоін Ян

1 Ключова лабораторія імунітету та обміну речовин Цзянсу, кафедра біології та імунології патогенів, медичний університет Сюйчжоу, м. Сюйчжоу, Китай

Мінсюань Чжен

Шаньшань Хао

Хонглі Ши

Даньхон Лін

Сі Чень

2 Інститут охорони здоров'я та медичних досліджень Illawarra (IHMRI), Медичний факультет, Університет Воллонгонг, Воллонгонг, штат Нью-Йорк, Австралія

Алек Бечваровський

Вей Пан

Пен Чжан

Мінмін Ху

Сю-Фен Хуан

Куйян Чжен

Інхуа Ю

Пов’язані дані

Усі набори даних, створені для цього дослідження, включені до статті/Додаткового матеріалу.

Анотація

Вступ

Ожиріння, яке є основною проблемою в галузі охорони здоров'я, не тільки тісно пов'язане із цукровим діабетом 2 типу, серцево-судинними захворюваннями, раком, депресією та іншими хронічними захворюваннями, але також є фактором ризику нейродегенеративних захворювань, таких як хвороба Альцгеймера (AD) та судинна деменція (Fruh, 2017; O'Brien та ін., 2017). Нейрозапалення є ознакою нейродегенеративних захворювань, пов’язаних з дієтою з високим вмістом жиру (ФВ) (Francis and Stevenson, 2013; Subhramanyam et al., 2019). Мікробіота кишечника відіграє важливу роль у роботі мозку та поведінці через вісь кишечника та мозку, тоді як дисбіоз мікробіоти має вирішальне значення у нейрозапаленні та когнітивних порушеннях (Erny et al., 2015; Sharon et al., 2016). Наприклад, розвиток мозку є аномальним, коли мікробіота кишечника відсутня у тварин, що не містять мікробів (Gareau et al., 2011; Clarke et al., 2013). Попередні дослідження без грибкових та антибактеріальних гризунів без патогенних гризунів показали, що дисбіоз мікробіоти кишечника негативно впливає на нейрогенез гіпокампа та розвиток мозку шляхом активації мікроглії (Erny et al., 2015; Sharon et al., 2016). Отже, дисбіоз мікробіоти кишечника є, очевидно, ключовим ініціюючим фактором нейрозапалення та подальшої дисфункції нейронів (Frohlich et al., 2016; Rogers et al., 2016; Sharon et al., 2016).

У цьому дослідженні модель ВЧ-дієтичної миші була використана для індукування когнітивних порушень і згодом оцінки ефекту добавки кудлану з їжею на різні параметри, включаючи склад мікробіоти кишечника, товщину слизу товстої кишки та білок щільного з'єднання та рівень ендотоксину в сироватці крові (LPS). . Крім того, прокогнітивну ефективність курдлану в цій моделі оцінювали шляхом вивчення нейрозапалення, рівня синаптичного білка та ультраструктури префронтальної кори (ПФК) та гіпокампу, які є двома ключовими сферами когніції. Це дослідження пропонує перші докази того, що дієтичні добавки з курдланом можуть покращити дисбактеріоз кишечника та захистити від когнітивних порушень при ожирінні, спричиненому дієтою, через вісь кишечника та мозку.

Матеріали і методи

Тварини та лікування

Аналіз мікробіоти кишечника

ДНК виділяли із вмісту сліпої кишки та проводили секвенування 16S рРНК, як описано раніше (Sun et al., 2019). Геномну ДНК із вмісту сліпої кишки витягували за допомогою набору ДНК для стільця HiPure (Magen, Пекін, Китай). Регіон V4 генів 16S рРНК ампліфікували та секвенували на платформі Illumina Miseq 2500 (Shanghai Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Оперативні таксономічні одиниці (OTU) та таксономія кожної послідовності гена 16S рРНК були проаналізовані, як повідомлялося раніше (Zhang et al., 2019).

Визначення LPS

Концентрацію LPS у сироватці крові визначали за допомогою хромогенного набору TAL кінцевої точки (Xiamen Bioendo Technology Co., Ltd., Xiamen, China). Поглинання вимірювали при 545 нм за допомогою спектрофотометра (Asuragen ClinBio128, США) з вимірюваними концентраціями в діапазоні від 0,1 до 1,0 ЄС/мл. Всі зразки для вимірювань LPS проводили у двох примірниках.

Гістологічне фарбування та імуногістохімія

Тестування поведінки

Пам'ять часового порядку, розпізнавання нових об'єктів та тести Y-лабіринту проводились для вивчення дієтичного впливу на просторову та розпізнавальну пам'ять на основі раніше описаних методів (Jin et al., 2016; Uribe-Marino et al., 2016; Zhang et al. ., 2019). У тесті пам'яті часового порядку індекс дискримінації обчислювався як [(Час зі старим об'єктом - Час із недавнім об'єктом)/Загальний час для обох об'єктів] × 100. У тесті розпізнавання нового об'єкта індекс дискримінації оцінювали за допомогою формула, [(Час із недавнім об’єктом - Час із старшим об’єктом)/Загальний час для обох об’єктів] × 100. Для тесту Y-лабіринт чергування визначалося як успішне послідовне входження в кожну з трьох груп. Триплет чергування (%) розраховували як [кількість успішних чергувань/(загальна кількість входів рук –2) × 100].

Трансмісійна електронна мікроскопія (TEM)

Після перкардіальної перфузії фізіологічним розчином витягували тканини головного мозку та розтинали 1 мм 3 тканинних блоків з PFC та ділянок CA1 гіпокампу. Зразки фіксували в суміші 2% параформальдегід-2,5% глутаральдегіду протягом 24 годин і обробляли після фіксації 1% тетраоксидом осмію (OsO4) протягом 2 годин, перед дегідратацією у висхідному градуйованому етанольному ряді та вбудовуванням в епоксидну смолу. Зрізи (70 нм) вирізали і фарбували 4% уранилацетатом і 0,5% цитратом свинцю. Ультраструктуру синапсів в області PFC та CA1 гіпокампу вимірювали під просвічуючим електронним мікроскопом (FEI, Портленд, Орегон, США) та вивчали синаптичну морфометрію. Посинаптичну щільність, ширину синаптичних щілин та кривизну синаптичного інтерфейсу визначали за допомогою програмного забезпечення ImageJ, як описано раніше (Wu et al., 2013).

Вестерн-блотинг

Вестерн-блот-аналізи проводили, як було описано раніше (Xu et al., 2018). Коротко кажучи, білки екстрагували з товстої кишки, гіпокампу та PFC в буфері лізису клітин, що містить буфер RIPA (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), коктейль інгібітора протеази (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) ) та 1 мМ PMSF (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Після кількісного визначення за допомогою аналізу BCA (Beyotime Biotech, Пекін, Китай), 40–80 мкг білка відокремлювали за допомогою 10% SDS-PAGE, а потім електротрансформували до мембрани полівінілідендифториду (PVDF) (BioRad, Геркулес, Каліфорнія, США). Вестерн-блот-аналізи проводили із застосуванням первинних антитіл, специфічних для Occludin (ab167161, abcam, Великобританія, розведення 1: 2000), похідного від мозку нейротрофічного фактора (BDNF) (ANT-010, Alomone labs, Ізраїль, розведення 1: 200), PSD- 95 (# 3450, Cell Signaling Technology, Бостон, Массачусетс, США, розведення 1: 1000) та GAPDH (A2077, ABclonal Biotechnology Co., Ltd., США, розведення 1: 2000). Вторинним антитілом був анти-кролячий IgG, кон'югований з пероксидазою хрону (sc-2030, Санта Круз Біотехнологія, США, розведення 1: 2000). Імунодетекцію проводили із застосуванням вестерн-блот-субстрату Clarity TM ECL (Bio-Rad, США) та візуалізували за допомогою системи візуалізації ChemiDoc Touch (Bio-Rad, США).

Вилучення РНК та кількісна (q) ПЛР у реальному часі (qPCR)

Екстракція РНК та qPCR проводились на основі методів, описаних раніше (Mei et al., 2019). Коротко кажучи, загальну РНК екстрагували TRIzol (Thermo Fisher Scientific, США) з товстої кишки, гіпокампу та PFC. Потім 2 мкг РНК було зворотно транскриптовано в кДНК за допомогою набору зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Takara, Японія). qPCR проводили за допомогою SYBR GREEN Master Mix (TaKaRa, Японія) та визначали за допомогою системи виявлення ПЛР у реальному часі (Bio-Rad, США). Рівні мРНК для конкретних генів розраховували за формулою 2 (–ΔΔCt) та нормалізували за рівнями мРНК β-актину. Всі праймери наведені в додатковій таблиці 1.

Статистичний аналіз

Вплив гострого добавки курдлану на споживання енергії, масу тіла та мікробні спільноти кишок у мишей, які отримували дієту з високим вмістом жиру (СН) протягом 7 днів. (A) Відносна кількість Firmicutes, (B) відносна чисельність Bacteroidetes, (C) відношення пропорції твердих речовин до пропорції бактеріоідів (співвідношення FM/BO), (D) відносна кількість протеобактерій і (E) відносна кількість антинобактерій. Значення є середніми ± стандартна похибка середніх значень. n = 5. * p # p ## p ### p 2.0 вважали значущим.

Вплив хронічного добавки курдлану на мікрогліоз та запалення в префронтальній корі (ПФК) та гіпокампі мишей, які харчуються ВЧ-дієтою. (A, B) Імуногістохімічне фарбування Iba1 в PFC (A) і кукурудзяний аммоніс (CA1), CA2-3 та область зубчастої звивини (DG) гіпокампу (B); (C – J) експресія мРНК TNF-α, IL-6, IL-1β та IL-10 в PFC (C – F) і гіпокампу (G – J). Значення є середніми ± стандартна похибка середніх значень. n = 5. * p # p ## p ### p Рисунки 5A – D). Однак, у порівнянні з ВЧ-дієтою, добавка курдлану послабила ці зміни синаптичної ультраструктури, демонструючи більш товсті PSD і вужчу синаптичну щілину (всі p Рисунки 5A – D). Тим часом ми також вимірювали рівні білків маркерів пластичності синапсів, BDNF та постсинаптичну щільність-95 (PSD-95) у PFC та гіпокампі мишей. У PFC експресія BDNF, але не PSD-95, пригнічувалась ВЧ-дієтою; однак це зниження BDNF не було помітним у мишей HFCurd [BDNF: F (2,12) = 11,5, p = 0,0016, PSD-95: F (2,12) = 0,9973, p = 0,3975, малюнки 5E, F ]. В гіпокампі як BDNF, так і PSD-95 були зменшені у HF мишей; однак жодного з цих скорочень не спостерігалося у мишей HFCurd [BDNF: F (2,12) = 5,698, p = 0,0182, PSD-95: F (2,12) = 13,72, p = 0,0008, малюнки 5G, H]. Ці результати вказують на те, що curdlan може покращити синаптичну морфологію та пластичність у PFC та гіпокампі.

У цьому дослідженні вплив курдлану на поліпшення пізнання вивчався лише у мишей із ожирінням самців. Дослідження чоловічих мишей було проведено, оскільки повідомляється, що у самців мишей більший ступінь дефіциту пізнання, спричинений ожирінням або діабетом, ніж у самок мишей (Fan et al., 2018). Крім того, дослідження мишей-самців може уникнути впливу естрогену та яєчників на поведінку когніції. Більше того, дослідження показали статеві відмінності в ожирінні та нейрозапаленні (Fan et al., 2018; Link and Reue, 2017). Наприклад, повідомляється, що самки захищені від запальної реакції, спричиненої західною дієтою, завдяки захисним ефектам рецептора естрогену α (Sample and Davidson, 2018), тоді як миші-самці мають сильніше запалення в центральній нервовій системі при розсіяному склерозі тваринна модель (Du et al., 2014). Отже, вплив добавок курдлану на пізнання та вісь кишечника та мозку у самок-мишей слід додатково вивчити в майбутніх дослідженнях до перекладу курдлану в клінічні випробування на жіночих людях.

Підводячи підсумок, це дослідження продемонструвало, що дієтичне додавання курдлану запобігає когнітивним дефіцитам, спричиненим ВЧ-дієтою у мишей. Ці сприятливі ефекти можна віднести на вісь товстої кишки та мозку. Наші висновки свідчать про механізм, за допомогою якого курдлан - як харчова добавка та пребіотик - може використовуватися для профілактики когнітивних порушень, спричинених надмірним споживанням західної дієти.

Заява про доступність даних

Усі набори даних, створені для цього дослідження, включені до статті/Додаткового матеріалу.

Заява про етику

Дослідження на тваринах було розглянуто та схвалено Комітетом з етики Медичного університету Сючжоу.