Бутанольна фракція зі стандартизованого екстракту стебла Cassia occidentalis L, доставлений за допомогою самоемульгуючої системи доставки ліків, захищає щурів від остеопенії, викликаної глюкокортикоїдами, та атрофії м’язів

Предмети

Анотація

Вступ

У всьому світі майже 60% пацієнтів з ревматоїдним артритом (РА) отримують лікування глюкокортикоїдами (ГХ) 1. Преднізон/метилпреднізолон, найчастіше застосовуваний ГК, призначається у поєднанні з антиревматичними препаратами, що модифікують захворювання (DMARD), щоб забезпечити кращі клінічні переваги. Однак тривале застосування ГК має кілька побічних ефектів метаболізму, і найбільш відомими серед них є остеопороз та саркопенія 2,3. Клінічно використовувані препарати для індукованого ГХ остеопорозу (ГІО) є антирезорбтивними засобами (бісфосфонати та деносумаб), тоді як захворювання в основному є наслідком порушення функції остеобластів 4. Хоча єдиний остеоанаболічний препарат, людський паратиреоїдний гормон 1–34 (терипаратид) виявив терапевтичну ефективність, більшу, ніж бісфосфонати, в ГІО 5,6,7,8,9,10, цей препарат не отримав схвалення для використання за цим показанням від США Food & Drug Administration (FDA), тим самим залишаючи поле для відкриття нового кісткоутворювача. Тривале лікування ГХ також викликає саркопенію 11. Скелетні м’язи надають позитивний сигнал кісткам через біомеханічне навантаження та саркопенію, для яких немає препарату, що ще більше погіршує здоров’я кісток.

Cassia occidentalis Л. (належить до Цезальпінієві родина) - це однорічна рослина, яка рясно поширена в широких районах Південної Азії та Південної Америки. Традиційне використання листя і стебла C. occidentalis для лікування переломів та захворювань кісток відомі з кінця дев'ятнадцятого століття в місті Путтур, переписному містечку району Чітхур штату Андхра-Прадеш, південний штат Індії, 12,13. Нещодавно ми показали, що бутанольна фракція виготовляється з етанолового екстракту C. occidentalisСтебло сприяє регенерації кісток у місці перелому та захищений від втрати кісткової маси та сили у щурів, спричиненої метилпреднізоном (MP) 14. У зв'язку з цим бутанольна фракція (CSE-Bu) виявилася більш сильною, ніж етанольний екстракт. Хоча CSE-Bu забезпечував значний захист від MP-індукованої втрати кісткової тканини, однак, він не був повним, що залишило поле для підвищення його ефективності.

Фітохімікати відомі своєю поганою біодоступністю у дозі та їх досягненням в природних умовах Для ефективності даного агента потрібні більш високі дози, що, в свою чергу, зменшує його терапевтичне вікно 15. Самонано-емульгуюча система доставки лікарських засобів (SEDDS) є ефективним підходом для посилення кишкової абсорбції гідрофобних сполук, які присутні в CSE-Bu, що призводить до їх поліпшеної біодоступності та більш послідовного часового профілю їх всмоктування. CSE-Bu містить шість остеогенних сполук, з яких ізовітексин мав найкращий остеогенний ефект в пробірці 14 .

Тут ми розробили SEDDS CSE-Bu на основі ліпідів (препарат CSE-Bu, що позначається відтепер як CSE-BuF), щоб посилити абсорбцію і, отже, біодоступність остеогенних сполук, що містяться в CSE-Bu. Потім ми вивчали фармакокінетику та фармакодинаміку CSE-BuF. Крім того, ми вивчали вплив CSE-BuF на протизапальну дію MP. Далі ми використовували модель остеотомії стегнової кістки щура для оцінки регенерації кістки та індуковану МП модель остеопенії для оцінки ефективності CSE-BuF та вивчали механізм його дії в кістці. Оскільки, як відомо, МП також спричиняє саркопенію, що, в свою чергу, сприяє втраті кісткової маси через зменшене механічне навантаження, ми, таким чином, вивчали вплив CSE-BuF на вплив МП на скелетні м'язи.

Результати

Характеристика CSE-BuF та його вплив на пероральну біодоступність остеогенних сполук

Встановлено, що розмір глобули CSE-BuF знаходиться в діапазоні 100-170 нм розведеної емульсії, а дзета-потенціал становив -28 мВ (рис. 1).

Розмір глобули та розподіл за розмірами SEDDS після розведення. Встановлено, що середній розмір глобули та PDI рецептури після розведення 1: 100 у дистильованій воді становив 166,7 днм та 0,186 відповідно.

Раніше ми виділили з CSE-Bu п’ять остеогенних сполук, включаючи емодин, лютеолін, 3 ′, 4 ′, 7-тригідроксифлавон (ТГФ), апігенін та ізовітексин. в пробірці аналізи 14. Серед цих сполук емодин та лютеолін можна вимірювати у плазмі після одноразового перорального введення CSE-Bu, тоді як апігенін, ізовітексин та ТГФ не виявлялися (табл. 1). Однак одноразове пероральне дозування CSE-BuF призвело до збільшення рівня емодіну та лютеоліну в плазмі порівняно з лікуванням CSE-Bu. Порівняно з CSE-Bu, відносна біодоступність емодину та лютеоліну збільшилась відповідно на 279% та 36% при лікуванні CSE-BuF. На відміну від CSE-Bu, рівні апігеніну, ізовітексину та THP виявляли та вимірювали у плазмі щурів, яким давали одноразове пероральне дозування CSE-BuF (табл. 1).

CSE-BuF посилював регенераційний ефект кістки

Регенерацію кісток, оцінену шляхом мічення кальцеїну в місці остеотомії стегна, порівнювали між CSE-BuF та CSE-Bu. Порівняно з транспортним засобом (вода), рецептура транспортного засобу (порожній SEDDS без екстракту) не впливала на маркування кальцеїну. При дозі 50 мг/кг CSE-Bu не мав ефекту, але CSE-BuF значно збільшував середню інтенсивність кальцеїну. Оцінка мікро CT (μCT) показала збільшення об’єму кістки мозоля (BV/TV) в CSE-BuF порівняно з групою CSE-Bu (рис. 2).

CSE-BuF повністю запобігав остеопенічному ефекту МП

Оскільки CSE-BuF у дозі 50 мг/кг стимулював значну регенерацію кісток у місці остеотомії, ми перевірили, чи може ця доза в цій дозі запобігти остеопенічному впливу МП. У групі МП значному зменшенню маси тіла (26%) сприяло зменшення як нежирної (11%), так і жирової маси (40%) порівняно з контролем. CSE-BuF запобігав індукованій МП втрати маси тіла, підтримуючи жирну і жирову масу до контрольних рівнів (Таблиця 2).

CSE-BuF повністю захищає метафіз стегнової кістки (трабекулярні кістки), діафіз стегнової кістки (коркова кістка) та хребці L5 (трабекулярна кістка) від індукованої МП втрати (рис. 3А-С). У метафізі стегнової кістки та L5 - мінеральна щільність кісткової тканини (МПК), об’єм кістки (BV/TV%) та мікроархітектурні параметри [число трабекул (Tb.N), товщина трабекул (Tb.Th) та відділення трабекул (Tb.Sp)] були порівнянними між контрольною та CSE-BuF групами (рис. 3А, Б). Індекс структурної моделі (SMI), показник геометрії трабекулярної кістки, також був порівнянним між цими двома групами (рис. 3A, B). Крім того, CSE-BuF повністю запобігав втраті МЩКТ, товщині кори та періостальному периметру діафізу стегнової кістки, спричиненої MP.

Ми провели аналіз подвійного мічення кальцеїну при діафізі стегнової кістки для вимірювання швидкості формування кісток. Репрезентативна мікрофотографія показала інтенсивне і безперервне маркування кальцеїну діафізу стегнової кістки, яке перетиналося щільно розташованим подвійним маркуванням у контрольній та MP + CSE-BuF групах, на відміну від слабкого та пошкодженого одиничного маркування, що спостерігається у групі MP (рис. 4А, верхня панель ). Розрахунок динамічних параметрів кісткового утворення на основі експерименту з подвійним кальцеїновим маркуванням показав значне зменшення мінералізуючої поверхні (pMS/BS), швидкості апозиції мінеральних речовин (pMAR) та швидкості формування кісток (pBFR/BS) у групі MP, порівняно з контролем ( Автомобіль). Ці параметри можна порівняти між контрольною та CSE-BuF групами (рис. 4А, нижня панель).

Оскільки втрата кісткової маси та мікроархітектура спричиняють втрату міцності кісток, ми вивчали міцність на стиск хребця L5 та міцність діафізу стегнової кістки на 3 точки. Лікування МП знизило всі параметри сили (пікове навантаження, енергію до руйнування та жорсткість) у діафізі хребця L5 та стегнової кістки, а CSE-BuF підтримувало всі три параметри в обох місцях до рівнів контрольних щурів (рис. 4B, C).

CSE-BuF запобігав зменшенню формування кісток і підвищеній резорбції МП, не впливаючи на його пригнічувальний ефект

Для вивчення механізму остеопотекції за допомогою CSE-BuF ми спочатку виміряли маркери обміну кісткової тканини в сироватці крові. MP пригнічує N-кінцевий пропептид типу I типу I (PINP, маркер кісткової формації) та підвищений зшитий C-телопептид колагену I типу (CTX-I, маркер резорбції кістки) порівняно з контролем (Veh) та CSE-BuF, що підтримується як до рівнів контролю (рис. 5А). Відповідно до зниженого PINP, рівня мРНК остеокальцину (OCN), остеобласт, що продукується неколагеновий матриксний білок, був суттєво пригнічений у групі МП порівняно з контролем, а лікування CSE-BuF значно збільшило його серед групи МП (рис. 5А). Крім того, дотримуючись підвищеного маркеру резорбції сироватки, ми спостерігали значне збільшення тартрат-стійкої кислої фосфатази (TRAP, остеокласт-специфічний фермент) в кістках групи, обробленої МП, над контролем, і CSE-BuF пригнічував її до рівня контролю ( Рис. 5А).

Остеоцити - це зрілі остеобласти, що потрапляють у кістковий матрикс і служать головним регулятором ремоделювання кісток шляхом секреції рецепторного активатора ліганду ядерного фактора каппа-((RANKL) 16. Апоптотичні остеоцити є надійними продуцентами RANKL, ключового остеокластогенного цитокіну 17,18. Відомо, що ГХ індукують апоптоз остеоцитів 19, і, відповідно, ми спостерігали значне зниження рівня мРНК маркерів остеоцитів: білок матриці дентину 1 (DMP-1), матрикс позаклітинного фосфоглікопротеїну (MEPE) та значне збільшення RANKL у кістках Група MP у порівнянні з контролем, і CSE-BuF запобігли індукованим MP зміни (рис. 5B). Склеростин, головним чином продукований остеоцитами білок, який інгібує функцію остеобластів, значно збільшився в сироватці крові щурів, які отримували МП, порівняно з контролем, однак CSE-BuF не мав ефекту порівняно з групою, обробленою МП (рис.

Щоб отримати уявлення про молекулярний механізм дії CSE-BuF, ми далі вимірювали різні рівні мікро РНК (miRNA) у кістках, які, як відомо, змінюються GC. Відомо, що miRNA 29a сприяє активності остеобластів за допомогою регулювання експресії Runx2, а MP пригнічує її експресію 20. Як miRNA 17, так і miRNA 20a інгібують експресію RANKL остеобластом, а GC пригнічують їх експресію 21,22. Відповідно до цих звітів ми спостерігали значне зниження рівнів miRNA 17, -20a та -29a в кістках щурів, оброблених МП, порівняно з контролем, а лікування CSE-BuF значно підвищувало рівні всіх трьох miRNA порівняно з групою MP ( 5D).

Потім ми перевірили, чи не передбачало попередження остеопенічного ефекту МП за допомогою CSE-BuF зміну протизапальної дії МП. Індукована глюкокортикоїдами лейцинова блискавка (GILZ) опосередковує протизапальну дію ГХ в різних органах, найголовніше, регулюючи діяльність Т-клітин тимусу 23. Лікування МП призвело до значного збільшення мРНК GILZ в тимусі та кістках порівняно з контролем, а CSE-BuF не змінив ефекту МП (рис. 5Е). Крім того, сироваткові рівні запального цитокіну IL-1β пригнічувались лікуванням МП, а CSE-BuF не впливав на пригнічення, викликане МП (рис. 5F).

CSE-BuF запобігає атрофії м’язів, спричиненій MP

Індукована МП атрофія м’язів спостерігалась із суттєво зменшеної площі перерізу та діаметра м’яза шлунково-кишкового м’яза Фере у порівнянні з контролем, і обидва параметри в групі CSE-BuF були вищими, ніж у контролю (рис. 6А). Крім того, лікування МП збільшило катаболічні білки м’язів, включаючи рівні атрогіну та м’язового білка-пальця РІНГ-пальця (MuRF-1), що спричинило атрофію м’язів, і CSE-BuF повністю придушив їх рівень до рівня контролю (рис. 6B).

Обговорення

SEDDS з'являється як ефективна система-носій для поліпшення біодоступності слабопоглинаючих сполук, що містяться в рослинних екстрактах. Хоча в більшості звітів використовуються чисті фітохімікати, цей підхід також застосовувався для підвищення біодоступності метоксифлавонів Kaempferia parviflora екстракт 24, гермакрон сухого кореневища с Curcuma zedoaria екстракт 25, білаболід і гінкголід А і В з Гінкго білоба екстракт 26 і протопін і тетрагідропалматин ризоми Corydalis decumbentis 27 .

Наші дані показують, що CSE-BuF, препарат на основі SEDDS у дозі 50 мг/кг, сприяє регенерації кісток і повністю запобігає індукованій МР остеосаркопенією у щурів, ймовірно, надійно збільшуючи біодоступність п’яти остеогенних сполук (апігенін, ізовітексин, THP, емодин та лютеолін), повідомлені нами на основі в пробірці аналізи 14. Серед них, в природних умовах повідомляється про ефект збереження кісток для апігеніну, емодину та лютеоліну 28,29,30,31,32. Ізовітексин також має в природних умовах остеогенний ефект на мишей (неопубліковані дані, S. Pal та N. Chattopadhyay).

Відповідно до підвищеної оральної біодоступності остеогенних сполук, ми спостерігали більш потужний остеогенний ефект CSE-BuF (при 50 мг/кг) в обох моделях, що використовувались тут, порівняно з попередньо повідомленим етанольним екстрактом C. occidentalis стебло (CSE, ефективна доза, 250 мг/кг) та CSE-Bu (ефективна доза 100 мг/кг) 14. Незважаючи на більші дози, CSE або CSE-Bu не змогли забезпечити повний захист скелета від індукованої МП втрати кісткової тканини, що зробив CSE-BuF 14, що припускало, що CSE-BuF був значно кращим, ніж неформульований екстракт/фракція.

Скелетний ефект CSE-BuF включав як остеоанаболічний, так і антирезорбтивний механізм. Враховуючи, що остеоанаболічна терапія (терипаратид) має кращий терапевтичний ефект на ГІО, ніж бісфосфонати 6,7,8,9,10, найбільш часто застосовувана антирезорбтивна терапія, а оскільки теріпаратид не є препаратом, затвердженим FDA для ГІО, існує необхідність для остеоанаболічного втручання для ГІО, яке потенційно може обслуговуватися CSE-BuF. Крім того, саркопенія, спричинена МП, у свою чергу вторинно впливає на кісткову масу, і її запобігали CSE-BuF. Крім того, несприятливі зміни в складі тіла, спричинені зниженням показника МП, як у нежирній, так і в жировій масі, запобігли CSE-BuF. У сукупності CSE-BuF забезпечує повний захист від індукованих МП змін остеопенії та саркопенії, які в другу чергу впливають на здоров'я кісток.

Остеоцити - це резидентні остеобласти матриці, які критично регулюють гомеостаз кісток, і одним з основних механізмів, за допомогою якого МП індукує остеопенію, є індукція апоптозу остеоцитів 36. Значний зворотний вплив сильного супресивного ефекту МР CSE-BuF на гени остеоцитів (DMP-1 та MEPE) свідчить про остеоанаболічний ефект, однак пізніше він не зміг придушити індуковане МР підвищення рівня склеростину в сироватці крові. Наші знахідки щодо придушення DMP-1 та MEPE за допомогою MP відрізняються від звіту, який не показує впливу преднізолону на поперековий хребці мишей 37. Цю різницю можна пояснити тим фактом, що контрольними мишами були самки C57BL/6, що несли трансген Atg 7-f/f, тоді як ми використовували самців щурів SD, і доза глюкокортикоїдів становила

На 60% менше (2,1 мг/кг), ніж наша доза (5 мг/кг). Таким чином, з нашого дослідження випливає, що зменшення остеоцитарних маркерів пов'язано з підвищеною продукцією склеростину за допомогою МР, і в той час як CSE-BuF пом'якшує вплив МР на експресію маркера, це не впливає на підвищений рівень остеобластів, що пригнічують інгібітор Wnt, склеростин. З наших даних виходить, що остеоанаболічний ефект CSE-BuF не зумовлений пригніченням рівня склеростину. Крім того, відомо, що глюкокортикоїди індукують апоптоз остеоцитів 38,39, а апоптотичні остеоцити надійно продукують потужний остеокластичний цитокін RANKL 40 і CSE-BuF, повністю блокуючи рівні мРНК цього цитокіну, індуковані MP. Як результат, CSE-BuF запобігав посиленій резорбції кісток, спричиненій MP, що було видно із сильно підвищеного вмісту CTX-1 у сироватці крові. На молекулярному рівні MP регулював інгібуючу РРНКЛ міРНК 17- та 20a, а Runx2 та β-катенін, що стабілізують miRNA 29a у кістках, та CSE-BuF запобігали цим змінам. Ці дані забезпечують клітинні та молекулярні механізми, що лежать в основі захисного ефекту CSE-BuF на індуковану МП втрату кісткової тканини.

Спостереження за сильним зв’язком між остеопенією та саркопенією при ряді захворювань та старінням призвели до ідентифікації кісток та скелетних м’язів як тканин, які пов’язані між собою анатомічно та функціонально. Втрата м’язової маси сприяє втраті кісткової маси через зменшення механічного навантаження кісток 41. Відомо, що хронічне використання ГХ викликає саркопенію, стимулюючи катаболічний шлях м’язів 11, і згідно з цим висновком ми спостерігали зменшення м’язової маси через зменшення розміру м’язів, спричинене регуляцією атрогіну-1 та MurF-1, білків, що належать до Е3 убиквитин-лігази. сім'я.

Питання безпеки та токсичності є критично важливими для клінічного перекладу терапевтичного втручання. Етанольний екстракт C. occidentalis до 2,5 г/кг не мали токсичності в гострих та підгострих дослідженнях 42. Хоча ми не проводили детальних досліджень токсичності з CSE-BuF, однак, смертність та втрата ваги внаслідок лікування CSE-BuF не спостерігались. Швидше за все, CSE-BuF повністю захищений від MP-індукованої втрати ваги тіла (як нежирної, так і жирової маси), що свідчить про його безпеку. Більше того, допоміжні речовини препарату відносяться до категорії “Загальновизнано безпечним” (GRAS) відповідно до FDA США і навряд чи мають токсичність.

Високі дози ГК клінічно застосовуються не тільки при РА, а й при інших хронічних запальних станах, таких як хронічна обструктивна хвороба легень та запальна хвороба кишечника. Тому перешкоджання протизапальній дії ГК на шляху захисту кісток є клінічно неприйнятним. Індукція GILZ GCs є суттєвою для їх протизапальної дії, і ми спостерігали, що MP, сильно регульований GILZ та CSE-BuF, не блокували цей ефект у тимусі та кістках. Крім того, CSE-BuF не впливав на супресію IL-1β, що опосередковується MP, у сироватці крові. Ці дані свідчать про те, що CSE-BuF можна профілактично використовувати для запобігання індукованій МП остеосаркопенії, не перешкоджаючи протизапальній дії препарату. На рисунку 7 схематично представлені основні висновки цього дослідження.

Принципова схема, що ілюструє вплив CSE-Bu або CSE-BUF на кістки щурів та скелетні м’язи, що даються одночасно з лікуванням МП. Зображення, використане на цьому малюнку, було зроблено Субхасіс Палом (автором цього рукопису). PK, фармакокінетика та PD: фармакодинаміка.