Аторвастатин допомагає зберегти функцію β-клітин підшлункової залози у мишей із ожирінням C57BL/6 J, і ефект пов’язаний із збільшенням проліферації підшлункової залози та покращенням стресу ендоплазматичного ретикулума

Анотація

Передумови

Інгібітори 3-гідрокси-3-метил-глутаріл КоА (HMG-CoA) редуктази або статини є конкурентними інгібіторами ферменту, що обмежує швидкість, у біосинтезі холестерину. В даний час статини використовуються як терапія першої лінії при лікуванні діабетичної дисліпідемії. Однак вплив статинів на функцію β-клітин залишається незрозумілим. Це дослідження має на меті вивчити ефекти лікування аторвастатином на функцію β-клітин підшлункової залози у мишей із ожирінням C57BL/6 J та можливі механізми.

Методи

Індуковане дієтою ожиріння (DIO) мишей C57BL/6 J лікували аторвастатином (30 мг/кг/день) протягом 58 днів. Функцію β-клітин оцінювали за допомогою гіперглікемічного затиску, а площу інсуліно-позитивних β-клітин досліджували за допомогою імунофлюоресценції. Експресію генів оцінювали за допомогою RT-PCR, а білки, пов’язані зі стресом ендоплазматичного ретикулума (ER), досліджували за допомогою вестерн-блот. Крім того, життєздатність клітин та апоптоз навантажених холестерином клітин NIT-1 досліджували після лікування аторвастатином.

Результати

Дослідження гіперглікемічного затиску показало, що швидкість інфузії глюкози (GIR) та коефіцієнт стимуляції інсуліну у мишей, які отримували аторвастатин, були значно вищими, ніж у контрольних мишей (P

Передумови

Статини є потужними інгібіторами біосинтезу холестерину. Засоби цього класу використовувались як засоби, що змінюють ліпіди, і виявляють сприятливий вплив на зменшення серцево-судинних ризиків [1–3]. Тим часом, оскільки ризик серцево-судинних захворювань підвищений при цукровому діабеті 2 типу [4], терапія статинами показана при метаболічному синдромі та хворим на цукровий діабет із серцево-судинними ризиками [5, 6].

Таким чином, чи впливає терапія статинами на розвиток діабету та на який аспект діабету це вплине, інтригує. Слід враховувати такі патологічні фактори, як резистентність до інсуліну та β-клітинна недостатність. З одного боку, нещодавні дослідження показали, що сприятливий вплив аторвастатину на резистентність до інсуліну зумовлений зменшенням запалення [7]. З іншого боку, функціональна β-клітинна маса розширювалася аторвастатином у новонароджених гризунів [8]. Однак, чи буде це впливати на функцію β-клітин, викликає занепокоєння. Клінічне дослідження дослідження ДІАТОР показало, що аторвастатин був ефективним уповільнювачем зниження функції бета-клітин [9]. Крім того, ризик діабету зменшився на 30% у дослідженні WOSCOPS [10]. Отже, ми припустили, що статини позитивно впливатимуть на функцію β-клітин.

Багато факторів сприяють дисфункції β-клітин, такі як стрес ER та дисфункція мітохондрій. Повідомляється, що стрес на ЕР відіграє ключову роль як у резистентності до інсуліну, так і при відмові β-клітин. Маркери стресу ЕР підвищені в печінці та жировій тканині при дієтах, спричинених ожирінням, і втручається дія інсуліну [11]. Оскільки ЕР служить фабрикою складання білка для інсуліну [12], більший попит на біосинтез та секрецію інсуліну, спричинений тривалим надмірним харчуванням, може спричинити стрес ЕР і поступово призводить до відмови β-клітин [13]. Докази кореляції між стресом ER та діабетом також походять із спостережень, що люди та миші, які мають мутації маркерів стресу ER, дволанцюжкової РНК-залежної протеїнкінази (PERK) та eIF2α є важко діабетичними [14, 15]. Острівці діабетичних мишей db/db демонструють підвищене фосфорилювання eIF2α та підвищення регуляції ATF4 та CHOP, що свідчить про наявність стресу ER [16]. Оскільки аторвастатин продемонстрував сприятливий вплив на поліпшення чутливості до інсуліну, ми припустили, що тягар ЕР до секретного інсуліну зменшився, і стрес ЕР може бути полегшений.

У нашому дослідженні ми використовували інсулінорезистентних мишей із ожирінням C57BL/6 J для оцінки впливу аторвастатину на функцію β-клітин, апоптоз β-клітин та стрес ER. Показано, що миші, які отримували аторвастатин, мали покращені ліпідні профілі, чутливість β-клітин до глюкози, проліферацію β-клітин та покращений стан стресу в порівнянні з контрольними мишами. Аторвастатин також захищав β-клітинну лінію NIT-1 від апоптозу, індукованого холестерином, та підвищеного антиапоптозного білка Bcl-2. Взяті разом, лікування аторвастатином приносить користь функції β-клітин підшлункової залози завдяки поліпшенню проліферації та послаблення стресу ER.

Результати

Аторвастатин покращує чутливість β-клітин до глюкози та ліпідних профілів мишей із ожирінням C57BL/6 J

За допомогою гіперглікемічного затиску ми дослідили функцію β-клітин. Відносно подібні концентрації глюкози в крові

14 ммоль/л стійких станів було досягнуто за 135 хв інфузії глюкози в обох групах (рис. 1А). У групі, яка отримувала аторвастатин, показник ГІР, що символізує метаболізм глюкози, був підвищений приблизно в 2 рази (46,0 ± 1,8 мг/кг/хв) порівняно з контрольною групою (20,8 ± 2,2 мг/кг/хв, P Рисунок 1

аторвастатин

Далі ми дослідили ліпідні профілі мишей, які отримували аторвастатин. На 58 день TG плазми крові і TG підшлункової залози очевидно зменшились (P Таблиця 1 Рівні ліпідів у плазмі та підшлунковій залозі мишей C57 наприкінці лікування аторвастатином на 58 день

Аторвастатин збільшує вагу підшлункової залози та індекс ваги та сприяє поліпшенню інсулінової позитивної β-клітинної площі

Далі ми дослідили вагу підшлункової залози та розрахували індекс ваги підшлункової залози. Вага підшлункової залози була значно важчою у групі аторвастатину, ніж у контрольній групі (Таблиця 2, Р 2 проти контролю 21337,9 ± 3151,8 мкм 2, Р Таблиця 2 Вплив аторвастатину на підшлункову залозу/індекс ваги мишей C57 наприкінці експерименту

Аторвастатин вгору регулює експресію гена Pdx-1 та LXR-β і пригнічує ER-стрес, знижуючи регулювання шляху peIF2α-ATF4-CHOP

Щоб визначити, чи існує вказаний механізм впливу аторвастатину, ми дослідили експресію гена підшлункової залози. Pdx-1, критично важлива молекула для проліферації клітин підшлункової залози та рецептор β печінки (LXR-β), який відіграє вирішальну роль у контролі ліпідного обміну, значно регулювались аторвастатином (Рисунок 3А, Р Малюнок 3

Аторвастатин збільшує виживання клітин NIT-1 в умовах апоптозу, викликаного навантаженням холестерином

Хоча проліферативний ефект був продемонстрований після лікування аторвастатином, залишається незрозумілим, чи розширення β-клітин також було обумовлено зниженням апоптозу. Таким чином, ми дослідили, чи модулює аторвастатин апоптотичну відповідь у β-клітинній лінії підшлункової залози NIT-1. Перш за все, ми дослідили, чи впливає аторвастатин на життєздатність клітин клітин NIT-1. Результати показали, що ніяких побічних ефектів на життєздатність клітин NIT-1 не було, а аторвастатин 10 -7 M-10 -5 M значно підвищував життєздатність клітин NIT-1 (Малюнок 4А). Цей проліферативний ефект при високій концентрації відповідає збільшенню площі β-клітин, що спостерігається у мишей C57. Лікування 0,125 мМ холестерину протягом 12 год знижувало життєздатність клітин NIT-1 на 67% (Малюнок 4B, P -9 -10 -5 M), покращувало життєздатність клітин NIT-1, оброблених 0,125 мМ холестерином залежно від дози ( P -9 -10 -7 M, P -6 -10 -5 M, малюнок 4B). Життєздатність клітин NIT-1, оброблених 10 -9 M та 10 -5 M аторвастатином, була на 163% та 219% вищою, ніж клітини NIT-1, оброблені лише холестерином. Далі аналіз проточної цитометрії показав, що оброблені холестерином клітини NIT-1 мали швидкість апоптозу 33 ± 2,1%, яка була зменшена до 24 ± 3,8% при обробці 10 -8 М аторвастатином (P Рисунок 4

Обговорення

У цьому дослідженні досліджували ефекти лікування аторвастатином на функцію β-клітин підшлункової залози у мишей із ожирінням C57BL/6 J та його можливий механізм. Після 58 днів лікування GIR та коефіцієнт стимуляції інсуліну у мишей, які отримували аторвастатин, покращилися порівняно з контрольними мишами. Крім того, ці миші мали більшу площу β-клітин, позитивних до інсуліну. Крім того, маркери стресу підшлункової залози були регульовані вниз. Результати in vitro свідчать про захисну роль аторвастатину проти індукованого холестерином апоптозу клітин NIT-1. Усі результати вказують на сприятливий вплив аторвастатину на функцію β-клітин.

Продемонстровано, що гіперглікемічний затискач є надійною методикою оцінки чутливості β-клітин до глюкози [17]. Оскільки рівень глюкози підтримується постійним, швидкість інфузії глюкози є показником метаболізму глюкози. Дефект початкової фази секреції інсуліну є найбільш раннім виявленим відхиленням при цукровому діабеті. Коефіцієнти стимуляції інсуліном першої та другої фаз були підвищені після лікування аторвастатином, що свідчить про збережену функцію β-клітин.

На сьогоднішній день багато дослідників продемонстрували сприятливий вплив аторвастатину на резистентність до інсуліну завдяки зменшенню запалення [7, 18, 19]. У тесті на гіперглікемічний затиск інсулін через 0 хв у групі аторвастатину був значно нижчим (p +/- миші демонстрували погіршення толерантності до глюкози та секреції інсуліну, а острівці були більш сприйнятливими до апоптозу [21].

Іншою можливою причиною збереженої функції β-клітин може бути покращення функції ендотелію. Ендотелій острівців відіграє важливу роль у забезпеченні киснем і поживними речовинами ендокринних клітин, швидкому проходженні секретованого інсуліну в кровообіг та транс-ендотеліальному проходженні секреції та регулювання рівня глюкози в крові [22, 23]. Дисфункція ендотелію була показана у пацієнтів із цукровим діабетом 1 і 2 типу. Покращений метаболічний контроль у хворих на цукровий діабет пов'язаний з майже відновленням функції ендотелію [24]. Оскільки було показано, що статини збільшують експресію eNOS та iNOS [25, 26], і можуть збільшувати вироблення NO, що призводить до розслаблення судин. Тому функція ендотелію може бути покращена. Повідомлялося, що аторвастатин покращує регенерацію маси β-клітин за рахунок збільшення клітин ендотелію інтро-острівців [8].

Як сильний зв’язок між стресом ER та діабетом [27, 28], ми спеціально дослідили, чи впливав аторвастатин на β-клітини підшлункової залози шляхом модуляції стресу ER. Після того, як напруга ЕР буде присутня, УПО буде спрацьовано для боротьби зі стресовими станами. Існують три чутливі білки, які потребують инозитолу 1α (IRE1α), PERK та активуючий фактор транскрипції 6 (ATF6) [29]. Що стосується шляху PERK, PERK фосфорилює eIF2α, і це призведе до більш ефективної трансляції ATF4. Чоп є нижчим білком шляху PERK – eIF2α – ATF4 і в основному індукує апоптоз, спричинений стресом ER в UPR [30]. Більше того, миші Chop -/- мали покращений глікемічний контроль та розширену масу бета-клітин [31]. У цьому дослідженні ми виявили, що шлях eIF2α – ATF4-Chop був відхилений після лікування аторвастатином. Однак, чи задіяні шляхи ATF6 та IRE1α, слід дослідити в подальшому дослідженні.

Модель індукованого холестерином апоптозу клітин NIT-1 надає нам інструмент для дослідження ефектів аторвастатину. Нещодавно було доведено, що холестерин викликає ER-стрес та апоптоз у макрофагах [32]. Оскільки діабет 2 типу супроводжується запаленням, ми імітували стан стресу ER, завантажуючи холестерин на клітини NIT-1. Ми виявили, що холестерин пригнічує життєздатність клітин NIT-1, яка послаблюється аторвастатином дозозалежно. Тест проточної цитометрії також показав, що аторвастатин покращує індукований холестерином апоптоз клітин NIT-1. Показано, що СНОР знижує регуляцію антиапоптотичного білка Bcl-2 [33], збережена експресія Bcl-2 у клітинах NIT-1 відповідає депресії експресії CHOP у підшлунковій залозі. Крім того, лише аторвастатин не негативно впливав на життєздатність клітин NIT-1 та підвищував життєздатність при високій концентрації. Цей результат може інтерпретувати збільшену площу β-клітин, позитивних до інсуліну, що спостерігається у мишей C57.

Однак деякі клінічні випробування виявили погіршення метаболізму глюкози статинів [6]. А FDA розширила рекомендації щодо ризику розвитку статину від розвитку діабету 2 типу. Можливість того, що пацієнти з серцево-судинними захворюваннями вже мають високий ризик розвитку діабету, не може бути вислана. Інше пояснення полягає в тому, що тривала агресивна терапія статинами може спричинити несприятливі ефекти.

У цьому дослідженні застосовували агресивну дозу аторвастатину. Доза 30 мг/кг/добу аторвастатину у мишей еквівалентна 170 мг/добу у людини 70 кг, розраховану на основі площі поверхні тіла (BSA) [34, 35]. Це більше, ніж рекомендована найвища доза 80 мг/добу. Для дорослих з діабетом Американська діабетична асоціація рекомендує агресивне використання статину при лікуванні діабетичної дисліпідемії [36]. У дослідженні REVERSAL агресивне зниження ліпідів за допомогою аторвастатину (80 мг/добу) показало сприятливі ефекти на зупинку прогресування атеросклерозу (-0,4%) порівняно з вихідним рівнем, і ефект перевершує симвастатин у дозі 40 мг [37]. Тим часом антиоксидантні та протизапальні переваги аторвастатину у дозі 80 мг також спостерігались на слідах MIRACL та ASAP [38, 39]. Крім того, у дослідженні DALI порівнювали агресивну (80 мг/добу) та помірну (10 мг/добу) гіполіпідемічну терапію аторвастатином [40]. Отже, ТГ натще зменшився на 35% при агресивній терапії та на 25% при помірній терапії. Таким чином, аторвастатин 80 мг/добу має кращий ефект на зміни вмісту ліпідної маси в порівнянні з 10 мг/добу.

Висновок

На закінчення, лікування інсулінорезистентних ожиріних мишей C57BL/6 J аторвастатином виявляє захисний ефект на функцію β-клітин підшлункової залози, і це пов’язано зі збільшенням проліферації підшлункової залози та зменшенням стресу ER. Очікується, що наш висновок забезпечить докази кращого та адекватного клінічного застосування аторвастатину.

Методи

Клітини

Лінія β-клітин підшлункової залози NIT-1 була придбана у ATCC (Манассас, штат Вірджинія) і культивована в DMEM/F12, що містить 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS) та 1% (об/об) антибіотиків (100 ОД/мл пеніциліну та 0,1 мг/мл стрептоміцину) при 37 ° C у зволоженій атмосфері, що містить 5% CO2 [41].

Дослідження тварин та гіперглікемічних затискачів

З усіма тваринами поводились відповідно до Стандартів для лабораторних тварин (GB14925-2001) та Керівних принципів з гуманного поводження з лабораторними тваринами (MOST 2006a), встановлених Китайською Народною Республікою. Дві рекомендації проводились відповідно до положень Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC), і всі протоколи щодо тварин були затверджені IACUC.

Гістологічні дослідження

Зразки тканин підшлункової залози фіксували на ніч у 10% формаліні, а потім вкладали парафін і розтинали товщиною 7 мкм. Зрізи тканин депарафінізували та послідовно регідратували у ксилолі, ксилолі/етанолі та градієнтному етанолі, а потім поміщали у дистильовану воду на 10 хв. Потім зрізи тканин підшлункової залози фарбували гематоксиліном та еозином (H&E), використовуючи стандартні протоколи.

Імунофлюоресценція

Зрізи тканин підшлункової залози, вкладені у парафін, депарафінізували за допомогою ксилолу, регідратованого градієнтним спиртом [43]. Зрізи промивали та інкубували з мишачими антиінсуліновими антитілами (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія), а потім з кон'югованим FITC козячим антимишачим IgG (Zhongshan Jinqiao Co., Пекін, Китай). Зображення отримували за допомогою конфокального мікроскопа Leica TCS SP2 (Nikon) та аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Image pro plus 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, США). До кожної групи було включено по три тварини. Проаналізовано щонайменше три зрізи від кожної тварини. Для кожного зрізу визначали площу інсуліно-позитивної β-клітини на кожному острівці та розраховували середню площу.

Кількісна ПЛР у реальному часі

Загальну клітинну РНК екстрагували з тканини підшлункової залози мишей C57BL/6 J з використанням реагенту Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Реакції зворотної транскрипції для отримання кДНК першої ланцюга проводили за допомогою набору синтезу кДНК першого ланцюга VigoScript (Vigorous Biotechnologies Beijing Co., Ltd.). ДНКаза без РНК-ази (Promega, Madison, WI) використовувалась для деградації ДНК до виявлення qPCR. Кількісну ПЛР у реальному часі (qPCR) проводили на системі ПЛР у режимі реального часу ABI 7000 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) з використанням набору SYBR Premix Ex Taq (TakaRa, Японія). Всі зразки аналізували в трьох примірниках і нормалізували за допомогою β-актину, що використовується як внутрішній контроль. Послідовності праймерів були такими: β-актин, 5′- AGAAGATCTGGCACCACACC 3 ′ (сенс) і 5′-TACGACCAGAGGCATACAGG-3 ′ (антисмисловий); Pdx-1, 5′-CCCGAATGGAACCGAGCCT-3 ′ (сенс) та 5′-CCCGAGGTCACCGCACAAT-3 ′ (антисмисловий); LXR-β, 5′-AAGGACTTCACCTACAGCAAGGA-3 ′ (сенс) та 5′ – GAACTCGAAGATGGGATTGATGA-3 ′ (антисмисл).

Вестерн-блот

Гомогенати тканин підшлункової залози готували в буфері для лізису (50 мМ Трис-HCl, 2% SDS та 10% гліцерину), доповненому коктейлем інгібітора протеази (Applygen Inc., Пекін, Китай), як описано раніше [44]. Крім того, клітинні лізати клітин NIT-1 готували, як зображено раніше [45]. Білки розщеплювали за допомогою SDS-PAGE і аналізи імуноблотингу проводили, як вже згадувалося раніше [21]. Були використані наступні антитіла (розведення 1: 1000, якщо не вказано інше): загальний eIF2α (sc-11386, 1: 500), ATF4 (sc-200), PDX-1 (sc-25403) та CHOP (sc-575), Bcl-2 (sc-7382) (усі від Santa Cruz Biotechnology), фосфо-EIF2α (Ser51, 9721) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) та β-актин (Abmart, 1: 2000). Білкові смуги візуалізували за допомогою хемілюмінесценції (ChemiScope2850, CLiNX Science Instruments), а щільність аналізували за допомогою програмного забезпечення Gel-Pro-Analyzer 3.1.

Біохімічний аналіз

Тригліцериди плазми (TG), TG підшлункової залози, холестерин у плазмі (CHO) та CHO підшлункової залози визначали ферментативними колориметричними методами з використанням комерційних наборів (BioSino Inc., Китай). Інсулін у плазмі крові вимірювали методом ІФА (Alpco. Inc., США).

Аналізи життєздатності клітин та апоптозу

Клітини NIT-1 висівали в 96-лунковий планшет при 2,3 × 104 клітин/лунку і культивували в середовищі DMEM/F12, доповненій 10% FBS. Коли клітини досягли 80% злиття, їх інкубували з 0,125 мМ водорозчинного холестерину (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Місурі) протягом 12 год у відсутність або присутність аторвастатину в концентрації від 10 -9 до 10 -5 М. Після цього клітини NIT-1 тестували на життєздатність за допомогою набору CCK-8 (Dojindo Laboratories, Кумамото, Японія). Дослідження проводили 3 рази з 5 лунками в кожній групі. Для аналізів апоптозу клітини NIT-1 висівали в 6-лункову платівку щільністю 4 × 10 5 клітин/лунку. Коли клітини злилися на 80%, їх інкубували з 0,125 мМ водорозчинного холестерину протягом 18 год з 10 -8 М аторвастатином або без нього [46]. Потім клітини перетравлювали і фіксували 70% етанолом та інкубували з 50 мкг/мл йодиду пропідію та 1 мкг/мл РНКази без ДНКази. Забарвлені клітини аналізували на проточному цитометрі (Бекман-Коултер, Бреа, Каліфорнія), а кількість апоптотичних клітин на пізній стадії аналізували за допомогою програмного забезпечення System II.

Статистичний аналіз

Дані виражали як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (SEM). Дані, отримані в цьому дослідженні, аналізували за допомогою ANOVA. Значення р